差異基因的篩選是基于統(tǒng)計學意義的，不能直觀的通過兩個數值的大小判斷差異基因的，首先：受測序深度的影響，有些樣品的測序深度較深，可能導致該樣品的readcount數值較高，做差異分析的第一步就是要消除測序深度的影響，對原始數據進行標準化處理（我們在有重復項目中，使用DESeq自帶的標準化方法；無重復項目中，使用TMM標準化方法）。

其次：在差異分析過程中，需要對readcount的分布進行估計，經驗表明，readcount服從負二項分布。在有重復的項目中，重復的好壞也會對差異基因與否產生影響。如果重復較差，組內差異情況會屏蔽掉部分組間的差異。在估計完參數后，需要用特定檢驗方法來判斷差異基因與否。

再次：在計算完pvalue以后，需要對pvalue進行多重假設檢驗校正，來減少假陽性。這個過程會使得padj會大于原來的pvalue，使得部分通過pvalue閥值的基因，無法通過padj的閥值。

在做差異分析時，是采用readcount數據，通過DESeq或者TMM標準化后，進行差異分析。FPKM/RPKM實際上也是對readcount進行標準化處理的一種方法，在進行差異分析時，DESeq和TMM的標準化效果最好，FPKM/RPKM的標準化效果較差，不推薦使用FPKM/RPKM進行差異分析。

在RNA-seq技術中，FPKM(expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced)是每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長度的fragments數目，其同時考慮了測序深度和基因長度對fragments計數的影響，是目前最為常用的基因表達水平估算方法

大多數真核基因轉錄產生的mRNA前體是按一種方式剪切產生出一種mRNA，因而只產生一種蛋白質。但有些基因產生的mRNA前體可按不同的方式剪切，產生出兩種或更多種mRNA，即可變剪切。