研究背景葫蘆素是一種苦味極高的化合物，主要存在于絲瓜屬的葫蘆科植物中。然而，目前還沒有對絲瓜果實中葫蘆素生物合成的綜合分析。因此，該文章對絲瓜苦味(WM709)和非苦味(S1174)基因型進行分析，通過整合代謝組和轉錄組分析來揭示葫蘆素生物合成的潛在機制。該文章共檢測到422種代謝物，包括維生素、必需氨基酸、抗氧化劑和抗腫瘤物質。其中131種代謝產物在苦絲瓜果實(WM709)和非苦絲瓜果實(S1174)之間存在顯著差異。苦絲瓜中異葫蘆素B、葫蘆素D、23、24-二氫葫蘆素E、葫蘆素F的含量顯著高于非苦絲瓜。轉錄組分析顯示，Bi、細胞色素p450s (CYP450s)和葫蘆素合成途徑的酰基轉移酶(ACT)顯著上調。此外，干旱脅迫和脫落酸(ABA)激活了葫蘆素生物合成途徑的基因。此外，雙熒光素酶報告基因和酵母單雜交實驗表明，aba反應元件結合因子1 (AREB1)結合到Bi啟動子上，激活Bi表達。對絲瓜和黃瓜基因組的比較分析表明，Bi、CYP450s和ACT位于保守的共順位點，并形成葫蘆素生物合成簇。本研究為深入了解葫蘆素生物合成途徑的主要基因和代謝產物提供了重要線索，加深了對葫蘆素生物合成調控機制的認識。

研究材料

絲瓜非苦果S1174和苦果WM709進行了研究。

技術方法：轉錄組學，熒光定量PCR，酵母單雜實驗。

研究結果

1. 兩個絲瓜品種果實代謝產物的鑒定

通過代謝組分析，探討絲瓜S1174和WM709兩個品種間的代謝物差異。共檢測出2個品種的422種代謝產物，通過heatmap分析，可以清楚地區分出兩個品種的代謝物(圖1C)。因此，根據OPLS-DA將6個樣本進一步分為兩組(圖2)。

圖1 代謝物分析結果

圖2 OPLS-DA結果

2. 代謝物功能分析

通過對差異代謝物進行分析發現，這兩個品種間有131個代謝物存在顯著差異，其中61個上調，70個下調。對差異代謝物的KEGG通路分析顯示，富集程度最高的5種途徑分別為甘油磷脂、α -亞麻酸、嘌呤、嘧啶和亞油酸代謝。此外，泛素和萜類醌生物合成代謝物途徑顯著富集。在苦絲瓜S1174中，高水平的代謝產物富集了嘌呤代謝、嘧啶代謝和ABC轉運蛋白(圖3)。此外還發現苦絲瓜中萜類化合物的含量顯著高于非苦絲瓜(圖4B)。

 圖3 代謝物富集分析結果

圖4 代謝物富集分析結果

3. 兩個絲瓜品種果實中差異表達基因的研究

通過對差異表達基因的研究，最終在兩個品種間鑒定出2634個差異表達基因，其中上調基因1455個，下調基因1179。轉錄組分析發現，在WM709和S1174之間有222個差異表達基因(98個上調，124個下調)，并且給出了其分別屬于的代謝途徑。

圖5 差異表達基因分析結果

4. 葫蘆素生物合成途徑基因的表達

考慮到黃瓜中葫蘆素的生物合成及其調控途徑，作者以黃瓜基因的氨基酸序列為查詢對象，對絲瓜中的Bt、Bi、ACT、CYP450s和UGTs同源基因進行了BLASTP搜索。結果表明，LaBi基因與黃瓜Bi同源，其編碼一個氧化角鯊烯環化酶(OSC)，該基因在WM709中表達量高于在S1174中(圖6A)。此外，5個CYP450s基因和ACT基因顯著上調(圖6B)。

圖6 基因表達分析結果

5. 干旱脅迫和ABA處理激活葫蘆素生物合成基因

通過對絲瓜幼苗進行干旱脅迫和ABA處理，驗證脅迫是否激活葫蘆素基因。結果表明，干旱脅迫和ABA處理顯著增加了Bi、ACT和CYP450s的表達(圖7A,B)。作者隨后進行了雙熒光素酶報告基因檢測和酵母單雜交實驗。結果表明，AREB1通過直接結合LaBi啟動子正向調控LaBi的表達。

圖7 熒光定量PCR以及酵母單雜

小結

綜合代謝組和轉錄組分析表明絲瓜是一種重要的藥用植物，具有很高的營養價值。在本研究中，苦絲瓜中有11種萜類化合物，包括葫蘆素D、葫蘆素F和23,24-二氫葫蘆素E上調。葫蘆素生物合成基因Bi、CYP450s和ACT均顯著上調，形成基因簇，維持葫蘆素的有效生物合成。在受到脅迫的絲瓜中，AREB1與Bi啟動子結合，激活Bi的表達。這些發現揭示了葫蘆素生物合成和非生物脅迫反應之間的直接聯系，并加深了對葫蘆素生物合成調控機制的理解。

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