肝癌75-85%為肝細胞癌（HCC），基因組分析表明，TERT啟動子、CTNNB1（編碼β-連環蛋白）和TP53（編碼p53）在HCC中經常發生突變，而參與氧化應激反應、染色質重塑和肝細胞分化等關鍵過程的基因則反復發生突變，但HCC2-4中的突變率低于10%。轉錄組層面的分子分型分析顯示，HCC不同亞型在細胞增殖、干細胞功能、代謝、肝細胞分化和肝功能相關的基因表達上存在差異。之前主要是關于早期和HBV相關的HCC的蛋白質組研究，但對其磷酸化蛋白質組的描述相對較少。2022年5月Nature Communications發表題為“Integrative proteogenomic characterization of hepatocellular carcinoma across etiologies and stages”的論文，研究人員基于高通量磷酸化蛋白質組為核心的多組學技術對不同病因和臨床階段的HCC樣本進行蛋白質基因組分析，不僅揭示HCC的廣泛分子異質性，還概述了HCC的蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學的分子分型，揭示了肝癌不同亞型發生發展中關鍵的調控通路，對肝癌的發生發展分子機制以及藥物潛在靶點研究具有重要意義。

研究材料

114名患者的122份HCC活檢樣本和115份非腫瘤組織

研究結果

1.多組學分析HCC的通路變化

研究收集了114名患者的122個腫瘤的活檢標本，進行全外顯子組測序和RNA測序，并對51種腫瘤子集進行DIA蛋白質組和非標記磷酸化蛋白質組分析。主成分分析表明，HCC在轉錄組、蛋白質組和磷酸化蛋白質組水平上與正常肝臟不同，且變化更大。為了確定HCC中相關途徑的變化，對HCC轉錄組和蛋白質組與正常肝臟進行了差異表達分析，觀察到轉錄組和蛋白質組之間存在中度相關性；同時四象限分析的結果顯示在這兩個組學水平上不同通路表達上調和下調的情況，如：mRNA剪接相關的通路整體上調，與正常肝功能相關的通路下調，翻譯控制相關通路僅在mRNA水平上調，與凝血和補體相關的通路僅在蛋白水平上調。

圖1 HCC中發生變化的通路

2. CNA-mRNA-protein相關分析確定候選驅動基因

研究人員評估了拷貝數改變（CNA）、mRNA表達和蛋白質（protein）表達之間的相關性，重點研究了136個表現出高CAN-mRNA和mRNA-protein相關性的基因，特別是通過GISTIC2分析后的5個CNA區域內的29個基因，這些基因在27–61%的隊列中獲得或丟失。在這29基因中，有19個在mRNA水平上失調，11個在蛋白質水平上失調，9例在這兩個水平上失調（ATP6V1C1、BYSL、CHD1L、NUDCD1、LRRC47、RRM2B、UBQLN4、XPO5、YWHAZ）。CAN-mRNA和mRNA-protein表達相關性的分析表明，不同的途徑在不同水平上受到調節，并確定了潛在的HCC驅動基因，如NUDCD1、UBQLN4、BYSL、ATP6V1C1和RRM2B，它們參與多種過程，包括EMT、細胞周期和DNA損傷調節，以及Wnt-β-連環蛋白、AKT \/mTOR和Notch通路的調節。

圖2 CNA mRNA與蛋白質的相關性

3. 肝癌中蛋白磷酸化水平明顯改變

接下來，研究了HCC中的蛋白質磷酸化情況。差異表達分析顯示，與正常肝臟相比，高磷酸化和低磷酸化位點分別為692個和648個，富集分析顯示，高磷酸化位點位于參與細胞周期、mRNA剪接、免疫系統、癌癥相關信號通路（如受體酪氨酸激酶和MAP激酶）以及PTEN和p53調節的蛋白質中，AKT、FGFR、VEGF、TGFβ信號也在高磷酸化蛋白中富集；在次磷酸化位點中，組蛋白修飾相關過程豐富。結果表明，HCC中磷酸化的改變影響了從細胞增殖和DNA修復到免疫系統和信號轉導途徑的廣泛生物學過程。 

圖3 CAN-mRNA與蛋白質的相關性

4.蛋白質基因組分析顯著突變基因

利用全外顯子組測序，在122例腫瘤活檢中鑒定出24488例體細胞突變（23660例單核苷酸變體和828例插入和缺失）。使用MutSigCV和OncodriveFML鑒定了7個顯著突變的基因，其中CTNNB1和TP53是HCC中最常見的兩個突變基因，為了評估與CTNNB1和TP53突變相關的分子變化，進行了差異表達。在CTNNB1突變體中鑒定出3067個差異表達基因，在TP53突變體HCC中鑒定出3949個差異表達基因；在CTNNB1突變體中鑒定出23個差異表達蛋白，在TP53突變體HCC中鑒定出399個差異表達蛋白。蛋白質基因組分析表明，CTNNB1突變HCC中出現的上皮表型缺失可能是由于參與肌動蛋白絲組織的蛋白質磷酸化的改變，從而調節細胞極性和遷移，而TP53突變HCC與脂質代謝和細胞周期控制相關蛋白的磷酸化改變有關。 

圖4 SMG的蛋白質基因組分析

5. 肝癌的分子分型

蛋白質組和磷酸蛋白質組都鑒定出兩個簇。蛋白質組亞型1與核糖核蛋白組織、mRNA剪接和加工相關，而亞型2參與代謝和氧化磷酸化；磷酸蛋白質組亞型1也與核糖核蛋白組裝、mRNA剪接和加工有關，磷酸蛋白質組亞型2與端粒維持、核小體組織、DNA修復、肌動蛋白細胞骨架調節和PKA C-α激活相關。蛋白質組簇與Edmondson分級和Hoshida分子亞型相關。為了評估單個組學和綜合分子亞型是否具有預后，進行了單變量和多變量Cox比例風險分析。總之，雖然蛋白質組數據的分子聚類在很大程度上概括了轉錄組和組織學分級的分子聚類，但磷酸化蛋白質組數據的分子聚類不同于其他單一組學和綜合聚類。

圖5 肝癌的蛋白質組分子分型

小結

肝細胞癌（HCC）的蛋白質基因組學分析集中于早期HBV相關HCC。該研究對CAN-mRNA-protein相關性、磷酸化蛋白質組和HCC整合簇的分析提出了一些推測的驅動因素和藥物靶點。研究描述了參與上皮細胞向間充質細胞轉化的候選拷貝數驅動基因，Wnt-β-連環蛋白，AKT \/mTOR和Notch途徑，細胞周期和DNA損傷調節。CTNNB1和TP53突變分別與肌動蛋白絲組織和脂質代謝相關的蛋白磷酸化改變相關。整合蛋白基因組簇表明，HCC構成異質亞群，具有明顯的生物過程調節、代謝重編程和激酶激活。該研究全面概述了HCC的蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學，揭示了蛋白質組中改變的主要途徑。

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