水果發(fā)育是高等植物生命周期中的一個獨特過程，有助于代謝物的產(chǎn)生，為人類提供富含促進(jìn)健康的化合物的飲食。目前果實發(fā)育雖已在作物領(lǐng)域獲得廣泛關(guān)注，但對多年生果樹背后的代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)仍然知之甚少。

不同發(fā)育階段的梨果肉

代謝組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組、DNA甲基組和小RNA譜

作者在果樹開花后4周～24周，每2周收集一次梨果肉，標(biāo)記為S1~S11。首先對單果重量、縱向和橫向直徑、可溶性糖和乙烯含量進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果呈逐漸增加趨勢，乙烯含量在S10和S11時大幅增加。代謝組學(xué)分析共鑒定出492種代謝物，對差異代謝物（DEM）進(jìn)行分析，結(jié)果表明，其積累趨勢呈現(xiàn)8個簇，如辛醇在早期含量較高，這與果肉的木質(zhì)化有關(guān)；L-丙氨酸、L-苯丙氨酸和L-纈氨酸在S6和S7含量較高，可能與果實增大有關(guān)；S10和S11中ABA、乙烯和可溶性糖含量較高，這些與果實的成熟有關(guān)。

對相鄰兩個階段的差異代謝物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，早期階段的過渡期在代謝物種類上的差異更明顯，且早期果實增大和后期果實成熟所對應(yīng)的代謝物存在差異。

圖1 梨果肉發(fā)育過程中的代謝組學(xué)分析

為了建立基因?qū)Υx調(diào)控之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，作者對梨果肉樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組檢測，并與代謝組學(xué)進(jìn)行了聯(lián)合分析。蛋白質(zhì)組共檢測到5106種蛋白質(zhì)，對每個階段的差異蛋白（DEP）進(jìn)行分析，共得到3469種差異表達(dá)蛋白（圖2a）。對DEP和DEM進(jìn)行聯(lián)合分析，采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)，得到2513個差異蛋白與423個差異代謝物相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組測序共得到33051個基因，分析得到22055個差異基因(DEG)（圖2b）。對DEG和DEM進(jìn)行聯(lián)合分析，采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)，得到14399個差異基因，包含2218個差異蛋白編碼基因與439個差異代謝物相關(guān)。

剔除在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平與代謝物不一致的爭議基因后，作者構(gòu)建了一個全面的基因-代謝物數(shù)據(jù)庫，包含了101種代謝物的途徑信息，其中有63種與其途徑基因呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。比如花青素-3-半乳糖苷與各種花青素生物合成基因呈正相關(guān)（圖2c），蔗糖和葡萄糖與糖代謝相關(guān)基因呈正相關(guān)（圖2d），ABA與其生物合成基因呈正相關(guān)（圖2e）等。

為了研究各種代謝途徑的潛在調(diào)節(jié)，作者構(gòu)建了每個代謝物簇中不同類別代謝物間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖2f），比如在檢測到的10個與10個與ABA生物合成的基因，其中8個與蔗糖和葡萄糖也有關(guān)。

圖2. 梨果肉轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組綜合分析

對果肉樣本進(jìn)行DNA甲基化測序，共得到39016459個胞嘧啶甲基化位點。在果肉發(fā)育過程中，DNA甲基化水平在整個基因組和CHH區(qū)域逐漸增加（圖3a）。

為了研究DNA甲基化對基因表達(dá)的影響，作者發(fā)現(xiàn)6209個差異基因的表達(dá)水平與其對應(yīng)啟動子中胞嘧啶甲基化水平相關(guān)（圖3b）。為了驗證這一點，作者用50 mM 5-azacytidine（5'-AZa）一種DNA甲基化抑制劑處理梨肉愈傷組織（圖3c），通過DNA甲基化測序和轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果表明，處理后胞嘧啶甲基化水平降低，其中1328個基因的表達(dá)水平與DNA甲基化相關(guān)(圖3d)。

為了確定果肉中DEG啟動子中的甲基化區(qū)域，在各階段之間分析了富含胞嘧啶甲基化位點的區(qū)域的甲基化水平。在果肉中35,176個基因的啟動子中，共發(fā)現(xiàn)了178499個DMR（圖3e）。在排除S1和其他階段之間沒有差異表達(dá)的基因后，發(fā)現(xiàn)56.67%至78.17%的基因在果實愈傷組織中被5’-Aza處理抑制，與S1相比，在后期（從S3到S11）的發(fā)育果實中表達(dá)更高（圖3f）。這些結(jié)果表明，這些18672個DEG的表達(dá)可能被果肉中的DNA甲基化所修飾。值得注意的是，95.58%的這些DEG被CHH-DMR修飾（圖3g），表明與CG和CHG-DMR相比，CHH-DMR可能在修飾果肉中的全基因組基因表達(dá)方面發(fā)揮更重要的作用。

圖3. 梨果肉發(fā)育期間DNA甲基化參與基因轉(zhuǎn)錄

為了闡明梨肉發(fā)育期間DNA甲基化增加的潛在機制，作者最初采用系統(tǒng)發(fā)育分析來識別涉及RdDM通路的基因，以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因，但未發(fā)現(xiàn)其與DNA甲基化水平的相關(guān)性。

植物甲基化的調(diào)節(jié)涉及DNA甲基化和DNA脫甲基化過程之間的動態(tài)相互作用。為了確定梨果肉中DNA脫甲基酶基因的表達(dá)模式，作者從梨基因組中確定了擬南芥ROS1基因的八個梨同源體。在這些基因中，PbDME1.1、PbDME1.2和PbDME1.3在果肉中沒有表達(dá)，PbDME1.4、PbDME1.5和PbROS1.3的表達(dá)水平在肉體發(fā)育過程中逐漸下降（圖4a）并與C和CHH甲基化水平呈負(fù)相關(guān)（圖4b）。此外，PbROS1.1和PbROS1.2的表達(dá)水平在果肉中逐漸從S5下降到S11（圖4a）。這些結(jié)果表明，這五個基因的表達(dá)減少與梨肉發(fā)育過程中DNA甲基化的增加是一致的（圖4c）。

此外，考慮擬南芥IDM1在催化組蛋白H3K18乙酰化方面的作用，以創(chuàng)造一個促進(jìn)ROS1功能的染色質(zhì)環(huán)境，作者從梨基因組中確定了擬南芥IDM1基因的三個梨同源基因。PbIDM1.1、PbIDM1.2和PbIDM1.3的表達(dá)水平在肉體發(fā)育過程中也逐漸下降（圖4a）并與C和CHH甲基化水平呈負(fù)相關(guān)（圖4b）。因此，所有三個IDM基因表達(dá)下調(diào)與果肉發(fā)育過程中DNA甲基化水平升高一致。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明，梨肉發(fā)育過程中DNA甲基化水平的升高可能源于DNA脫甲基相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)。

圖4. 梨果肉發(fā)育過程中脫甲基酶基因的表達(dá)減少與DNA甲基化的增加一致

為了說明這些DAMs與DEGs啟動子中的DNA甲基化之間的關(guān)系，作者進(jìn)行了相關(guān)分析，揭示了3987個DEGs啟動子中的DNA甲基化與所有八個集群中存在316個DAM相關(guān)。結(jié)果表明，DNA甲基化可能通過影響參與代謝物合成相關(guān)基因的表達(dá)，在調(diào)節(jié)果肉代謝物方面發(fā)揮作用。

此外，鑒定出大多數(shù)與ABA、蔗糖和葡萄糖的合成和代謝過程相關(guān)的DMR修飾的DEG，以及部分DEG啟動子中的DNA甲基化，甚至在整個基因組中，與ABA、蔗糖和葡萄糖相關(guān)。ABA是一種重要的植物激素，通過增加可溶性糖（包括蔗糖和葡萄糖）含量和乙烯釋放來促進(jìn)梨果成熟。因此，DNA甲基化可能通過影響ABA生物合成來參與梨肉的發(fā)育。為了驗證這一假設(shè)，在S9的果皮下用5'-Aza處理梨果肉（圖5a），進(jìn)行DNA甲基化測序，發(fā)現(xiàn)胞嘧啶甲基化水平下降（圖5b）。與對照組相比，5'-Aza處理促進(jìn)了葉綠素在果皮中的積累（圖5c），導(dǎo)致果皮呈現(xiàn)綠色（圖5a）。此外，與對照組相比，5'-Aza處理促進(jìn)了ABA、β-胡蘿卜素和葉黃素在肉中的生物合成（圖5c）。這一結(jié)果表明，DNA甲基化參與類胡蘿卜素代謝，并可能通過增加ABA的產(chǎn)生來加速果實成熟。

為了說明DNA甲基化對類胡蘿卜素代謝的調(diào)節(jié)，對用5'-Aza和H2O處理的果肉進(jìn)行了定量實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析。在DMR修飾的DEG中，10個途徑基因和35個TF的表達(dá)水平與ABA含量呈正相關(guān)。與對照組相比，通過5'-Aza處理，PbPSY、PbHYB1和PbAAO的表達(dá)水平在果肉中上調(diào)，而PbZDS1和PbSDR2表達(dá)沒有顯著差異（圖5d）。這些結(jié)果表明，DNA甲基化抑制了PbPSY、PbHYB1和PbAAO的表達(dá)，以限制果肉中的ABA生產(chǎn)。與對照組相比，通過5'-Aza處理，PbZF1、PbHB3、PbERF、PbB3.1、PbZFP4、PbbZIP1、PbGRAS3、PbbHLH3和PbNAC1的表達(dá)水平在果肉中上調(diào)，而PbZFP2、PbHB1、PbHB2、PbIAA2、PbIAA3、PbbHLH2和PbbHLH1表達(dá)沒有顯著差異（圖5d）。這些結(jié)果表明，DNA甲基化減少可能會促進(jìn)幾個TF的表達(dá)，以誘導(dǎo)PbPSY、PbHYB1和PbAAO的表達(dá)。此外，與對照組相比，PbIAA1和PbMYB1在果肉中下調(diào)5'-Aza處理（圖5d），表明DNA甲基化減少也可以抑制基因表達(dá)。

圖5 DNA甲基化參與梨果肉代謝

為了探究TFs對ABA生物合成的潛在參與，作者使用ABA生物合成基因的啟動子進(jìn)行了雙熒光素酶實驗。根據(jù)表達(dá)和DNA甲基化分析，總共選擇了12個TF（圖5d）。結(jié)果表明，在PbPSY、PbZDS1、PbHYB1、PbSDR2和PbAAO啟動子的控制下，LUC基因被測試的12個TF中的至少三個顯著激活（圖6a）。這表明這12個TF可能會激活參與ABA生物合成的基因子集。

AAO是一種催化脫落醛轉(zhuǎn)化為ABA的關(guān)鍵酶（圖2e）。雙熒光素酶測定表明，PbAAO啟動子的活性可以增加屬于五個不同家族的9個TF（圖6a）。據(jù)報道，在這些家庭中，ZFP、Homeobox、MYB和bHLH TFs參與了水果成熟。為了測試這些家族中已識別的TFs與PbAAO啟動子之間的直接相互作用，進(jìn)行了雙熒光素酶檢測，并表明PbMYB1和PbbHLH1的可能結(jié)合區(qū)域位于上游區(qū)域內(nèi)。進(jìn)一步分析表明，PbHB1和PbHB2/PbHB3的可能結(jié)合區(qū)域位于上游區(qū)域內(nèi)。酵母單雜實驗表明，PbZFP1、PbHB1、PbHB2和PbHB3可以結(jié)合到PbAAO起始密碼的-500 bp至-100 bp的上游區(qū)域（圖6b）。電泳遷移率位移分析（EMSA）還表明，PbZFP1與含有C2H2型ZFP預(yù)測結(jié)合位點的探針A直接相互作用，而PbHB1、PbHB2和PbHB3可以在三個HB TF的已識別結(jié)合區(qū)域與探針B直接相互作用（圖6c）。這些結(jié)果表明，這些TF可以與PbAAO啟動子進(jìn)行物理相互作用，以增強其活性。

此外，在過表達(dá)PbZFP1的果肉愈傷組織中，PbZFP1、PbHYB1、PbSDR2和PbAAO的表達(dá)水平以及ABA含量顯著增加（圖6d，e）。其次在S9時，過表達(dá)PbZFP1的果肉中，PbZFP1、PbHYB1、PbSDR2和PbAAO的表達(dá)水平以及ABA含量也有所增加（圖6f，g），PbZFP1沉默的果肉中，PbZFP1、PbHYB1、PbSDR2和PbAAO的表達(dá)水平以及ABA含量有所下降（圖6h，i）。這些結(jié)果表明，PbZFP1在果肉中積極介導(dǎo)ABA生物合成。

圖6. PbZFP1在果肉中積極介導(dǎo)ABA生物合成

從本文不難看出，完成植物生理機制（梨果實發(fā)育）的深度解析需在傳統(tǒng)的單一組學(xué)視角基礎(chǔ)上加以拓展。這種“代謝表型-蛋白功能-基因調(diào)控”的多層級耦合分析，不僅能驗證代謝標(biāo)志物的生物學(xué)意義，更可溯源其積累的驅(qū)動機制。

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