胃腸道含有人體最大的免疫器官，還有大量的微生物。微生物在宿主體內平衡中發揮著關鍵作用，如產生代謝物、抵抗病毒和病原體感染以及促進免疫系統成熟。由于腸道微生物群調節的代謝物，提供不易消化的化合物可以對宿主帶來有益的生理作用；其中一些化合物被稱為益生元。益生元益處的一個關鍵機制是腸道微生物群從不易消化的碳水化合物中產生短鏈脂肪酸 （SCFA），它可以降低腸道 pH 值以排除病原體并具有抗菌活性。益生元食品在健康方面具有重要作用，尤其是通過調節腸道微生物群以改善新陳代謝來治療超重或肥胖。
火參果（Cucumis metuliferus）又名非洲黃瓜、刺角瓜、果凍瓜，屬于葫蘆科。它自然分布于非洲的熱帶和亞熱帶撒哈拉以南地區，在肯尼亞、新西蘭、法國、以色列、澳大利亞、中國等地也有商業生產。據報道，火參果果實具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗潰瘍和降血糖活性。果皮的重量約占整個獼猴桃的四分之一，是榨汁后的副產品。獼猴桃皮的成分是碳水化合物（54.84%）、水分（18.40%）、纖維（11.34%）、脂肪（8.89%）、灰分（3.59%）、蛋白質（2.95%）。含有生物堿、黃酮類、皂苷、單寧、甙、萜類和酚類。從成分分析的結果來看，多糖在獼猴桃中所占的比例最大。一般來說，果皮的細胞壁富含果膠，果膠由半乳糖醛酸（Gal A）、半乳糖醛酸（Gal A）、葡萄糖（Glu）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖醛酸（Gal）和鼠李糖（Rha）組成等。果膠的組成和結構與功能有關，包括抗氧化能力、免疫活性和體外抗癌活性。此外，來自不同來源的果膠對腸道微生物群有不同的影響。果膠的各種特性顯示出很高的生物活性；然而，來自 C. metuliferus 果皮的果膠（CMPP）通常被丟棄和忽視。因此，這值得進一步研究。
2022年5月31日，華南農業大學食品學院廣東省食品質量安全重點實驗室在Foods（IF=5.354）雜志上在線發表了“Immunological Activity and Gut Microbiota Modulation of Pectin from Kiwano （Cucumis metuliferus） Peels”的研究論文。通過單糖分析和紫外和可見光譜闡明了 CMPP 的組成。在此基礎上，利用小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）的細胞活力和免疫因子（NO、TNF-α、IL-6）評價CMPP的免疫活性。用人體腸道的動態模擬器（BFBL）模擬人體內環境，例如：pH、溫度、厭氧和停留時間。該模型用于評估人類腸道微生物群落結構以及銨和短鏈脂肪酸產生的變化。
實驗路線
圖 1. 實驗流程圖
通過化學方法破譯CMPP主要成分。CMPP中未檢測到黃酮和多酚。此外，在紫外光譜中未觀察到 260 nm 和 280 nm 處的吸收峰，表明在 CMPP 中也未檢測到核酸和蛋白質。使用 HPAEC-PAD 檢測單糖組成。如圖2所示，CMPP主要由10種單糖組成，包括半乳糖醛酸（Gal A）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖醛酸（Gal）、葡萄糖（Glu）、木糖（Xyl）、Fuc（巖藻糖）、葡萄糖酸（Glu A）、甘露糖酸（Man A）和甘露糖（Man）。因此，單糖組成結果表明CMPP為果膠多糖。
圖 2. CMPP 的單糖組成
2.細胞實驗
2.1 細胞活力
使用 MTT 晶體形成來評估 CMPP 在 RAW264.7巨噬細胞上的細胞活力。與空白對照相比，CMPP 在 0.78–50 μg/mL 濃度下 24 h 的細胞活力高于100%（圖 3），顯著提高到 134% ± 9% 和 144% ± 12%（p < 0.01）。結果表明 CMPP 無細胞毒性，在 0.78-50 μg/mL 的 RAW264.7 上可促進細胞增殖。因此，該濃度范圍可考慮用于后續研究。
圖 3. CMPP 對 RAW264.7 巨噬細胞細胞活力的影響。細胞活力值超過 100% 意味著促進細胞生長。數據表示為平均值±標準差。** 高度顯著與對照組不同，p < 0.01。
2.2 免疫活性
巨噬細胞的免疫反應與人類健康高度相關，細胞因子（NO、IL-6、TNF-a）分泌的增加常被用來評估免疫活性。如圖4 A所示，CMPP在0.78-50 ug/mL濃度范圍內顯著（p < 0.01）增加NO生成，且呈劑量依賴性；TNF-a的釋放（圖4B）也隨CMPP濃度的增加而顯著增加（p < 0.01），且呈劑量依賴性；當CMPP濃度為50 ug/mL時，RAW264.7細胞的IL-6分泌明顯增加（圖4C） （p < 0.01）。在CMPP最高濃度（50 μg/mL）時，NO、TNF-a和IL-6的產生均低于LPS組，提示CMPP的免疫調節作用強于LPS。綜合來看，CMPP具有免疫活性。
圖4. CMPP激活的RAW264.7細胞產生NO （A）、TNF-a （B）和IL-6 （C）。LPS組為過量生產的陽性組，0.78 ~ 50 ug/mL的CMPP較LPS組更為溫和。數據以平均值±標準差表示。**與對照組（0 ug/mL）差異極顯著，p < 0.01。
3.微生物代謝物分析
3.1 短鏈脂肪酸含量
腸道菌群消化碳水化合物代謝的主要代謝產物是短鏈脂肪酸。升結腸（AC）、橫結腸（TC）和降結腸（DC）三個隔室在穩定期、進樣期和沖洗期的短鏈脂肪酸（SCFAs）濃度結果如圖5所示。穩定期的短鏈脂肪酸含量以乙酸居首，丁酸和丙酸次之。與穩定期相比，在攝食期AC、TC和DC的乙酸含量平均分別增加了1.07、1.05和1.10倍。AC、TC和DC的丙酸含量分別提高了1.26、1.21和1.24倍;丁酸含量分別提高了1.07、1.10和1.22倍。乙酸、丁酸和丙酸在采食期均有增加，尤其是DC組（p < 0.05）。隨后，在沖洗期SCFAs濃度下降，其數據與穩定期相似。短鏈脂肪酸是果膠多糖發酵的重要產物。半乳糖和半乳糖醛酸經發酵得到乙酸和丁酸。醋酸作為肌肉的主要能量來源參與脂質代謝。丁酸與保護上皮細胞有關，具有抗炎作用，而丙酸主要是阿拉伯糖和葡萄糖發酵的產物，與能量途徑的調節和飽腹肽/激素的釋放有關。結合單糖組成結果，CMPP富含Gal A、Ara、Gal和Rha，可發酵增加短鏈脂肪酸。3個隔室丙酸均顯著（p < 0.05）增加，表明CMPP可使丙酸菌產生利用。
圖5. 穩定期（s-p）、攝食期（i-p）和沖洗期（w-p）在升結腸（AC）、橫結腸（TC）和降結腸（DC）中短鏈脂肪酸（SCFAs）含量。數據以平均值±標準差表示。*與穩定期比較差異顯著，p < 0.05。
3.2 銨含量
測定銨的含量是為了評價蛋白質的發酵，蛋白質水解發酵的代謝產物或最終產物有潛在的毒性。結果表明，銨態氮含量在穩定期的AC、TC和DC分別達到12.58 ± 2.34 mM、15.65 ± 2.34 mM和14.32 ± 0.74 mM的平均值（±SD）；經CMPP干預后，三種反應器中銨的含量分別下降（AC為10.17 ± 0.50 mM, TC為13.21 ± 1.54 mM, DC為13.62 ± 0.45 mM）；與采食期相比，洗脫期銨態氮含量有所增加，AC為10.28 ± 1.35 mM, TC為14.24 ± 1.50 mM, DC為13.98 ± 0.97 結果表明，在CMPP攝入期間，蛋白質水解代謝下降。當人類和動物模型補充不可消化的碳水化合物時，大腸內蛋白質發酵的減少，降低糞便水的遺傳毒性是一致的。
3.3 腸道菌群分析
通過BFBL腸道模型中腸道菌群的變化，分析了CMPP潛在的益生前效應。在此基礎上，通過qPCR檢測三個試驗期最后3天在AC、TC和DC的平均細菌計數（表1）。與穩定期相比，在CMPP攝入期間Bacteroides、Feacalibacterium和Roseburia的菌群數量增加。雖然AC中Akkermansia的數據低于檢測水平，但TC中有增加的趨勢。Akkermansia可以利用CMPP中的半乳糖和葡萄糖作為碳源生產丙酸。據報道，Akkermansia與炎癥性疾病的改善和對代謝性疾病的保護有關，包括預防2型糖尿病（T2D）和減少心血管疾病；Bacteroides在試驗期間增加，主要是在AC （p < 0.05），這與丙酸和乙酸的產生有關。中國T2D患者中Akkermansia、Bacteroides、Feacalibacterium和Roseburia減少；另一方面，Bifidobacterium在試驗期間有輕微的增加趨勢，但不顯著。該屬可降解多種碳源，包括單糖和雙糖，以及木糖、半乳糖和低聚果糖等復雜碳水化合物。Bifidobacterium通過發酵碳水化合物產生乙酸和乳酸，并通過交叉飼喂機制刺激丁酸的產生。Bifidobacterium還可改善糖尿病相關并發癥及肥胖；CMPP也有增加TC和DC中Feacalibacterium的趨勢（p < 0.05）。與慢性胰腺炎患者和肥胖組相比，對照組的Feacalibacterium較高，與炎癥改善也呈正相關；CMPP處理后Roseburia明顯增加，以AC組的最為明顯（p < 0.05）。它可以發酵幾種碳水化合物，包括木糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉和糖原。研究表明，健康人的Roseburia豐度高于T2D患者。Feacalibacterium和Roseburia被認為是丁酸[49]的主要生產者，他們的減少被標記為預測歐洲婦女的糖尿病。總的來說，攝入期間增加的細菌群主要與T2D、肥胖和減輕炎癥有關，提示CMPP可以改善這些癥狀。
表1. CMPP胃腸道消化過程中用于細菌組分析的qPCR計數平均值（log copy number/mL）。*與穩定期比較差異顯著，p <0.05。
為了更好地了解CMPP對健康的影響，還需要進一步研究以下問題：（1）確定有利于健康的CMPP適宜濃度范圍和干預時間。將 CMPP 鑒定為益生元并確定合適的劑量是具有挑戰性的，但也是有益的。（2）了解CMPP對體內腸道菌群及相關疾病的復雜影響，根據腸道菌群的功能特性，建立相關數據庫，進行個性化營養管理。（3）解讀加工方式對CMPP的影響，發展食品行業果蔬副產品的回收利用。這些研究將對果膠、腸道菌群和宿主健康之間的關系至關重要。
通訊作者介紹：
Teresa Requena，女，博士，西班牙馬德里食品科學研究所-生物技術與微生物學系首席研究員。主要研究方向為腸道微生物。
王弘，女，博士，華南農業大學食品學院教授，博士生導師，廣東省珠江學者特聘教授，廣東省生物工程學會生物傳感器專業委員會副主任委員，廣東省高等學校“千百十”工程省級培養對象。主要研究方向為食品安全與營養。
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