研究對象：

動物模型：采用DSS（葡聚糖硫酸鈉）誘導(dǎo)的UC小鼠模型，模擬人類UC的腸道炎癥和黏膜損傷。

分組設(shè)計：正常對照組（無干預(yù)）、UC模型組（僅DSS誘導(dǎo)）和MPD治療組（高劑量組（H 劑量）和低劑量組（L 劑量）），每組8只小鼠。

技術(shù)方法：16S rRNA測序，非靶代謝組學(xué)

動物實驗設(shè)計：

圖1. MPD 可顯著改善小鼠的結(jié)腸炎癥狀

1.MPD 的化學(xué)成分

根據(jù) UHPLC-MS/MS 的正離子和負(fù)離子模式，將 MPD 總離子流色譜圖 （TIC） 的色譜圖分為兩組（圖 2A、B）。使用 Compound discover 3.2 軟件從原始 Raw 質(zhì)譜數(shù)據(jù)中提取特征峰，特征峰元素匹配、分子式預(yù)測和同位素分布匹配的質(zhì)量數(shù)偏差均設(shè)置為 5 ppm 以內(nèi)。使用 mzCloud 在線數(shù)據(jù)庫和本地構(gòu)建的中藥天然產(chǎn)物 mzVault 數(shù)據(jù)庫來識別特征峰，共鑒定出144 種化合物。峰面積最大的主要化合物包括黃芩苷、七葉苷、沃格諾苷等（圖 2D）。

圖2. UHPLC-MS/MS 對 MPD 進行化學(xué)鑒定

2.MPD對小鼠體重和結(jié)腸的影響

研究人員將32只雄性 Balb/c 小鼠 （6-7周齡，20±2 g）隨機分為4組：對照組、模型組、H劑量組和L劑量組。如圖1A所示，模型、H 劑量和 L 劑量組施用3%（w/v） DSS溶液7天。在接下來的8天里，通常為每組小鼠提供無菌飲用水。L劑量組小鼠以10 g/kg的劑量給予粗草藥，H劑量組為20 g/kg。根據(jù)小鼠每10g體重0.1 mL的灌胃方案，對H劑量和L劑量組給予0.2 mL相應(yīng)的湯劑。同時，在相同條件下，對照組和模型組給予0.2 mL無菌水。在整個實驗過程中，對照組都提供無菌水。

為了評估結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，研究人員記錄了所有小鼠的每日體重測量值。結(jié)果表明與對照組相比，所有DSS處理的小鼠均出現(xiàn)體重減輕。值得注意的是，與模型組相比，H 劑量組在高劑量MPD給藥期間的體重趨于增加（圖 1B）。DSS處理的小鼠也表現(xiàn)出較短的結(jié)腸長度，但MPD治療顯著逆轉(zhuǎn)了這些變化，尤其是在較高劑量下（圖 1C、D、p < 0.05）。H劑量組和L劑量組結(jié)腸組織的隱窩結(jié)構(gòu)和形態(tài)均顯著改善，與DSS組相比，觀察到大量杯狀細(xì)胞并減少炎癥細(xì)胞浸潤。對照組腸道切片未發(fā)現(xiàn)明顯異常，上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤。相比之下，模型組表現(xiàn)出廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤。H劑量組和 L 劑量組的上皮細(xì)胞層相對完整，炎癥細(xì)胞較少。H劑量組和L劑量組之間沒有顯著差異（圖 1E）。

3.MPD對糞便樣本微生物群多樣性和組成的影響

收集新鮮糞便后從中提取微生物DNA，對16S rRNA 基因的V3-V4區(qū)域進行擴增和測序。維恩圖顯示了三組中存在443個OTU（圖 3A），主坐標(biāo)分析（PCoA） 揭示了對照組和 DSS 處理組之間不同的微生物組成集群（圖 3B）。這些結(jié)果表明 DSS 誘導(dǎo)小鼠糞便微生物群發(fā)生顯著變化。另外，與對照組相比，模型組和 H 劑量組的 Chao 1 和 Sobs 指數(shù)顯著降低 （p < 0.05），而 H 劑量組也表現(xiàn)出顯著較低的 ACE 指數(shù) （p < 0.05）。

研究人員進一步分析了門水平上最主要的微生物群，以評估各組之間腸道微生物群組成的總體變化（圖3C）。與對照組和 H 劑量組相比，模型組表現(xiàn)出較低的放線桿菌門相對豐度 （p < 0.05）。此外，模型組和H 劑量組均顯示彎曲桿菌門的相對豐度降低 （p < 0.05）。對每組中7 個主要屬的分析揭示了微生物類群的特定變化（圖 3D）。LEfSe 分析在對照組中確定了21個生物標(biāo)志物，在模型組中確定了8個，在H劑量組中確定了4個生物標(biāo)志物，表明由于DSS導(dǎo)致某些物種顯著減少，這導(dǎo)致DSS組盲腸微生物群的相對豐度較低（圖 4A）。葡萄球菌在門、屬和類水平 （LDA >4） 在模型組中占主導(dǎo)地位，而H劑量組（LDA >4）的Oscillospirates更豐富（圖4B）。

圖3. 不同組小鼠腸道微生物群

圖4. 描繪三組小鼠微生物群落之間分類關(guān)聯(lián)的LEfSe圖

4.MPD對腸道代謝的影響

通過LC-MS檢測結(jié)腸組織代謝物，篩選差異代謝物，并進行KEGG通路富集分析。正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）表明對照組和模型組樣品之間有明顯的分離（圖 5A），表明成功建立了DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型。MPD處理導(dǎo)致MPD和模型組樣品之間明顯分離（圖 5B）。差異代謝物的聚類熱圖分析顯示，MPD組的代謝物譜與對照組相似（圖 5C）。這些結(jié)果表明，MPD可有效改善DSS誘導(dǎo)的小鼠腸道代謝紊亂。

圖5. 三組小鼠微生物群落之間分類關(guān)聯(lián)的LEfSe圖

對模型組和 MPD 組代謝物數(shù)據(jù)的進一步分析顯示，與模型組相比，MPD 組有 53 種代謝物上調(diào)，22 種代謝物下調(diào)（圖 6A）。為了進行更精確的分析，使用投影中的變量重要性（VIP）表示差異代謝物（圖 6B）。倍數(shù)變化最大的前5位上調(diào)代謝物是（S）-7-（3-氨基-1-吡咯烷基）-1-環(huán)丙基-6-氟-1,4-二氫-4-氧代-1,8-萘啶-3-羧酸、Esculetin、戊二酸半醛、DTMP 和甘草酮。前五位下調(diào)代謝物包括依克多因、2-甲氧基雌酮、3-葡萄糖醛酸苷、蘇酰精氨酸、反式培苷和 13-L-氫過木酰油酸（圖 6C）。這些差異代謝物的 KEGG 富集分析表明，MPD主要影響亞油酸代謝、VEGF 信號通路、非洲錐蟲病、谷氨酸能突觸和 Fc ε RI 信號通路等通路（圖 6D）。

圖6 差異代謝物分析圖