近幾年，機制研究一直受到高分期刊編輯青睞，那么對于中醫(yī)藥領(lǐng)域，是否能借鑒類似的思路，提高課題成果水平？
說到中藥領(lǐng)域的機制研究，首先想到的研究對象必然是中藥方劑。曾經(jīng)，復(fù)雜的成分一直是闡釋中藥方劑作用機制的難點，而近幾年，隨著多組學(xué)技術(shù)的不斷突破，這一研究困境正在逐步改變。
結(jié)合十年科研經(jīng)驗，我們?yōu)樯罡嗅t(yī)藥創(chuàng)新的研究者量身定制了快速構(gòu)建高分中藥方劑研究課題的思路圖解：
面對中醫(yī)藥系統(tǒng)研究的特殊需求，我們提供從活性成分鑒定到驗證的整體解決方案，特色檢測項目廣泛覆蓋：
如何利用豐富的檢測手段，將課題思路框架擴展為一篇完整的文章？看完本篇出自北京協(xié)和醫(yī)院團隊的文章解析，或許能夠有所啟發(fā)……
糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）是糖尿病的一種常見且嚴重的并發(fā)癥，以周圍神經(jīng)的脫髓鞘和軸突變性為特征，影響至少一半的糖尿病患者。除了最佳的血糖控制外，目前尚無特定治療方法可以應(yīng)對由糖尿病引起的周圍神經(jīng)損傷。即使嚴格的血糖控制也無法完全阻止或逆轉(zhuǎn)DPN的進展。因此，有效的DPN治療在臨床實踐中是一個重大挑戰(zhàn)。盡管慢性高血糖會導(dǎo)致糖酵解升高和TCA循環(huán)紊亂，從而引起軸突變性和脫髓鞘，但中央碳水化合物代謝的整體視圖及其在DPN病理條件下的生物能量串擾尚未完全闡明。
24年2月發(fā)表在Journal of pharmaceutical analysis上的題為“Targeted metabolomics reveals the aberrant energy status in diabetic peripheral neuropathy and the neuroprotective mechanism of traditional Chinese medicine JinMaiTong”的文章，作者監(jiān)測旨在通過靶向代謝組學(xué)方法，全面了解DPN患者和鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的DPN大鼠的中央碳水化合物代謝概況。此外，探討傳統(tǒng)中藥金脈通（JMT）對DPN的神經(jīng)保護機制。
研究對象：DPN患者、健康對照組、RSC96細胞、雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠
技術(shù)方法：代謝組學(xué)分析、行為學(xué)和神經(jīng)功能測試、形態(tài)學(xué)評估、Western blot分析、細胞實驗
技術(shù)路線：
1.靶向代謝組學(xué)方法揭示了DPN患者和STZ誘導(dǎo)的DPN大鼠中央碳水化合物代謝的獨特特征
作者為了獲得與DPN相關(guān)的中央碳水化合物代謝特征的全景視圖，開發(fā)了一種使用HPIC-QTRAP-MS/MS平臺在25分鐘內(nèi)同時測定56種代謝物的靶向代謝組學(xué)方法（圖1A）。在人類血清樣本中，成功定量了41種靶向代謝物，通過PCA分析顯示DPN患者和健康受試者的代謝譜顯著不同（圖1E）；與對照組相比，DPN患者中有25種代謝物顯著變化（圖2A）。后續(xù)又對大鼠的血清和坐骨神經(jīng)組織進行檢測，分別檢測到52和50種代謝物，PCA得分圖顯示DPN大鼠和對照組在中央碳水化合物代謝方面有明顯的聚類，特別是在血清樣本中（圖1E），血清和坐骨神經(jīng)中分別有19和13種代謝物在組間顯著不同（圖2B）。KEGG通路分析顯示，DPN患者的血清中TCA循環(huán)顯著富集，其次是糖酵解/糖異生和戊糖磷酸途徑（圖2C）。
圖1 使用高效離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPIC-MS/MS) 進行靶向代謝組學(xué)分析，表征糖尿病周圍神經(jīng)病變 (DPN) 患者和DPN大鼠異常的中樞碳水化合物代謝
圖2 糖尿病性周圍神經(jīng)病變（DPN）中代謝物顯著變化的熱圖
2.中藥金脈通JMT在改善DPN大鼠的外周神經(jīng)功能方面的效果
使用STZ注射，構(gòu)建DPN大鼠模型，大鼠在整個實驗期間表現(xiàn)出持續(xù)且顯著的血糖水平升高（圖3A），STZ誘導(dǎo)的大鼠從第2周開始體重顯著下降（圖3B）。糖尿病大鼠機械痛閾值和運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MNCV）顯著降低而熱響應(yīng)潛伏期顯著增加（圖3C-F）。JMT和LA治療顯著改善了DPN大鼠的機械痛閾值、熱響應(yīng)潛伏期和動神經(jīng)傳導(dǎo)速度（圖4C-E）。這些結(jié)果表明，JMT顯著改善了DPN大鼠的外周神經(jīng)功能。
圖3 JMT改善DPN大鼠的周圍神經(jīng)功能并減輕周圍神經(jīng)的形態(tài)變化
3.JMT在減輕DPN大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化方面的效果
作者通過組織染色和透射電子顯微鏡多種染色和顯微鏡技術(shù)，展示了JMT在改善DPN大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化方面的顯著效果（圖3G-M）。這些結(jié)果不僅證實了JMT對DPN的神經(jīng)保護作用，還為其在臨床應(yīng)用提供了重要的實驗依據(jù)。
4.JMT在逆轉(zhuǎn)DPN大鼠髓鞘和軸突蛋白表達減少方面的效果
作者使用免疫熒光染色檢測背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中髓鞘堿性蛋白（MBP）和神經(jīng)絲重鏈（NF-H）的表達。發(fā)現(xiàn)JMT和LA治療均顯著增加了MBP和NF-H的表達，且JMT的效果優(yōu)于LA（圖3O和P）。這些結(jié)果表明JMT促進了DPN大鼠髓鞘和軸突的修復(fù)和再生。
5.JMT通過恢復(fù)DPN大鼠的中央碳水化合物代謝來發(fā)揮神經(jīng)保護作用的效果
使用HPIC-QTRAP-MS/MS平臺進行靶向代謝組學(xué)分析，檢測56種代謝物。通過PCA得分圖顯示DPN和DPN+JMT組之間的完全分離，表明JMT治療引起的代謝譜變化（圖1E）；坐骨神經(jīng)組織部分分離，表明JMT對坐骨神經(jīng)代謝的影響。代謝物方面，與DPN模型組相比，血清樣本中DPN+JMT組中有九種代謝物顯著增加，三種顯著減少，主要涉及TCA循環(huán)和戊糖磷酸途徑（圖4）。坐骨神經(jīng)組織中DPN和DPN+JMT組之間有七種代謝物含量顯著不同，其中三種是糖酵解途徑的中間體（圖4）。這些結(jié)果不僅證實了JMT可以通過恢復(fù)生物能量學(xué)來改善DPN，還為進一步理解JMT在DPN中的藥理機制提供了重要依據(jù)。
圖4 JMT治療可恢復(fù)DPN大鼠循環(huán)和坐骨神經(jīng)中紊亂的中樞碳水化合物代謝
6.JMT在體內(nèi)激活了AMPK/PGC-1α信號通路
Western blot分析AMPK/PGC-1α信號通路相關(guān)蛋白的表達水平結(jié)果表明，JMT 通過激活A(yù)MPK/PGC-1α 信號通路改善了DPN大鼠模型中的線粒體功能障礙和神經(jīng)病理損傷。JMT不僅促進了線粒體生物發(fā)生，還增強了線粒體呼吸功能和ATP生成能力。（圖5）
7.JMT在減輕DPN大鼠線粒體形態(tài)學(xué)損傷方面的效果
作者使用TEM觀察坐骨神經(jīng)中線粒體的超微結(jié)構(gòu)，JMT治療逆轉(zhuǎn)了這些形態(tài)學(xué)變化，線粒體形態(tài)恢復(fù)正常（圖5J和K）。這些結(jié)果表明JMT治療保護了坐骨神經(jīng)中的線粒體免受糖尿病神經(jīng)病變相關(guān)的形態(tài)學(xué)損傷，證實了JMT對DPN的神經(jīng)保護作用，還為其在臨床應(yīng)用提供了重要的實驗依據(jù)。
圖5 JMT激活腺苷酸（AMP）活化蛋白激酶（AMPK）信號通路，減輕DPN大鼠坐骨神經(jīng)（SN）線粒體的超微結(jié)構(gòu)損傷
圖6 JMT減輕高糖誘導(dǎo)的大鼠細胞系（RSC96）損傷
8.JMT通過AMPK途徑促進高糖環(huán)境下RSC96細胞增殖并抑制其凋亡的效果
作者使用大鼠施萬細胞系在高糖條件下培養(yǎng)，JMT以0.05 mg/mL的濃度與高糖共同處理72小時。使用流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，高糖顯著增加了細胞的凋亡群體（圖6A和B），JMT治療顯著減少了高糖引起的細胞凋亡，并增加了細胞的數(shù)量（圖6C和D）。共處理JMT和CC（AMPK抑制劑）消除了JMT對細胞凋亡和細胞數(shù)量的影響，表明JMT的作用與AMPK激活有關(guān)。CCK-8實驗則顯示高糖顯著抑制了細胞的增殖，而JMT逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)（圖6C）。
圖7 大鼠細胞系 (RSC96) 中的線粒體呼吸功能和腺苷酸 (AMP) 活化蛋白激酶 (AMPK)/增殖激活受體γ輔激活因子1-α (PGC-1α) 信號相關(guān)蛋白的表達
9.JMT通過AMPK途徑減輕高糖環(huán)境下RSC96細胞線粒體形態(tài)變化和呼吸功能障礙的效果
作者通過透射電子顯微鏡和Mito-tracker CMXRos染色等多種實驗技術(shù)，表明JMT通過激活A(yù)MPK途徑減輕高糖引起的RSC96細胞線粒體形態(tài)變化和呼吸功能障礙。JMT不僅改善了線粒體的超微結(jié)構(gòu)和膜電位，還增強了線粒體的呼吸功能和ATP生成，從而有助于神經(jīng)修復(fù)和再生（圖6-7）。
10.AMPK抑制劑對JMT激活PGC-1α信號通路的影響
AMPK是細胞能量穩(wěn)態(tài)的核心調(diào)控因子，在DPN中，AMPK的活性受到抑制。PGC-1α是AMPK的下游靶點，負責(zé)調(diào)控線粒體生物發(fā)生和功能。作者使用使用AMPK抑制劑 CC 來阻斷AMPK活性，觀察其對JMT調(diào)控 PGC-1α 的影響，通過 Western blot 和功能實驗，明確了JMT 通過AMPK/PGC-1α 信號通路改善高糖誘導(dǎo)的線粒體功能障礙的作用機制（圖7G-N）。
本文研究了JMT在DPN治療中的作用機制，強調(diào)了其通過調(diào)控能量代謝和線粒體功能來實現(xiàn)神經(jīng)保護的獨特優(yōu)勢。研究表明，JMT 的療效主要歸因于其對AMPK/PGC-1α 信號通路的激活以及對施萬細胞的保護作用。此外，JMT的多成分協(xié)同效應(yīng)為其臨床應(yīng)用提供了廣闊前景。然而，未來仍需進一步研究以明確其關(guān)鍵活性成分和作用靶點，推動其從實驗室走向臨床。
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排版：野凌
審核：三黍生物企宣部
