研究材料：楊樹幼苗根系、擬南芥

技術方法：轉錄組學、遺傳轉化、RT-PCR、體外相分離

技術路線：

技術路線圖

1.PagPCaP1a與楊樹的鹽脅迫響應密切相關

作者用200 mM NaCl溶液灌溉組織培養生長的植物6小時、12小時、24小時，對照組植物僅用水灌溉，然后收集植物根部進行轉錄組測序及組間差異分析（圖1A、B）。其中最為重要得是GO注釋描述為編碼質膜錨定蛋白的基因，Potri.003G157100，屬于PCaP家族。楊樹基因組包含兩個PCaP1基因，分別稱為PagPCaP1a和PagPCaP1b（圖1C）。PagPCaP1a和PagPCaP1b表現出相似的表達模式，在幼葉和莖中顯示出一些表達，而在幼根和成熟根中顯示出相對較高的表達水平（圖1D）。然而，與PagPCaP1a不同的是，PagPCaP1b的表達水平在鹽脅迫下基本保持不變甚至略有下降。RT-qPCR分析驗證了這一結果（圖1E）。以上結果表明，PagPCaP1a可能參與了楊樹的鹽脅迫響應。

圖1 鹽脅迫的楊樹苗中PagPCaP1b的鑒定和表達分析

2.PagPCaP1b會影響楊樹的鹽脅迫適應性和微管穩定性

為了評估PagPCaP1a在楊樹中的潛在生物學功能，通過遺傳轉化實驗選擇了三個PagPCaP1a過表達系（PagPCaP1a-OE）和一個PagPCaP1a基因的突變體。用200 mM NaCl灌溉種植在土壤中的3個月大的WT、Pagpcap1a突變體和OE轉基因植物進行為期兩周鹽脅迫處理，用水作為對照。

PagPCaP1a-OE植物的葉子比WT葉子更萎蔫，而Pagpcap1a突變體植物比WT表現得更好（圖2A）。與WT植物相比，PagPCaP1a-OE植物顯示出相反的表型，表現出較低的RWC和葉綠素含量以及較高的MDA含量（圖2B至D）。同時，在擬南芥的PagPCaP1a轉基因互補系（Com#1和Com#2）的存活率低于擬南芥pcap1突變體，恢復到WT（擬南芥品系Col-0）中觀察到的水平（圖2E和F）。這些發現表明，PagPCaP1a負調控楊樹對鹽脅迫的響應，其功能在擬南芥中是保守的。

由于PagPCaP1a同源物直接調控微管，為此將15天大的楊樹幼苗浸泡在含有200 mM NaCl的液體半強度Murashige和Skoog（MS）培養基中4小時或8小時，使用轉移到含NaCl的培養基之前的幼苗作為0小時對照。通過對β-微管蛋白進行免疫染色觀察WT、Pagpcap1a和PagPCaP1a-OE#1系中根細胞的皮層微管組織。在暴露于NaCl后，所有基因型的微管密度顯著下降（圖2G）。特別是，與WT細胞相比，Pagpcap1a細胞中的微管密度下降緩慢，而PagPCaP1a-OE#1細胞中的微管密度下降更快。

為了評估PagPCaP1a對微管的生化功能進行了體外共沉淀實驗。從大腸桿菌中生產并純化了His-PagPCaP1a，并將其與預先形成的Taxol穩定微管一起孵育，His-PagPCaP1a與Taxol穩定微管混合導致大部分PagPCaP1a與微管一起在沉淀中被回收（圖2H）。這一結果表明PagPCaP1a直接結合到微管上。另外通過可視化由羅丹明標記的微管蛋白預聚合的微管，單獨或在存在PagPCaP1a的情況下，研究了PagPCaP1a對微管動態的影響。顯微鏡觀察表明，與僅觀察微管的情況相比，加入His-PagPCaP1a后存在的微管較少（圖2，I和J）。這些結果表明，PagPCaP1a作為一個微管不穩定化蛋白，參與了鹽脅迫誘導的微管重組。

圖2 PagPCaP1b會影響楊樹的鹽脅迫適應性和微管穩定性

3.PagPCaP1a在鹽脅迫下在細胞中形成生物分子凝聚物

鑒于PagPCaP1a在鹽脅迫響應中的作用，作者評估了PagPCaP1a在正常生長條件下或暴露于鹽分壓力下的細胞中的亞細胞定位。通過農桿菌介導的浸潤將編碼PagPCaP1a-mCherry的構建體浸潤到煙草（Nicotiana benthamiana）葉中。確定PagPCaP1a-mCherry在鹽脅迫下形成誘導的凝聚物，與其在正常條件下的質膜定位相反（圖3A）。進一步研究PagPCaP1a在鹽脅迫下的楊樹中的定位，結果發現，在對照條件下，PagPCaP1a-GFP主要定位在質膜上，并在鹽處理10分鐘后迅速在細胞質中形成凝聚物（圖3B）。

為了確定PagPCaP1a凝聚物是否表現出液體樣特性，在楊樹原生質體中的PagPCaP1a-GFP凝聚物上進行了光漂白后熒光恢復（FRAP）實驗。在實驗后，PagPCaP1a-GFP迅速從未漂白區域重新分布到漂白區域（圖3，C和D），這表明這些凝聚物具有液體樣狀態。此外，PagPCaP1a-GFP在轉基因擬南芥proAtPCaP1:PagPCaP1a-GFP/pcap1互補幼苗的根細胞中暴露于鹽處理后迅速在細胞質中形成凝聚物（圖3，E和F），這些凝聚物在FRAP分析下也表現出類似的液體樣特性（圖3，G和H）。總之，這些觀察表明，PagPCaP1a蛋白在響應鹽脅迫時在體內形成具有液體樣特性的凝聚物。這些數據表明，PagPCaP1a蛋白可以形成動態的凝聚物，這種行為可能與液-液相分離（LLPS）有關。

為了確定鹽誘導的PagPCaP1a凝聚物形成是否依賴于Ca²⁺，在將proAtPCaP1:PagPCaP1a-GFP/pcap1轉基因幼苗暴露于200 mM NaCl之前，先用300 μM BAPTA-AM（一種可透過細胞的Ca²⁺螯合劑）預處理30分鐘，單獨或在存在BAPTA-AM的情況下暴露于NaCl。暴露于鹽脅迫后，BAPTA-AM大大損害了PagPCaP1a凝聚物的形成（圖3，I和J）。類似地，鈣通道阻斷劑LaCl3抑制了根細胞中PagPCaP1a凝聚物的形成（圖3，K和L）。這些結果表明，鹽誘導的[Ca²⁺]cyt升高在體內PagPCaP1a凝聚物的形成中起著關鍵作用。

圖3 PagPCaP1a響應鹽度脅迫而經歷可逆和動態凝聚

4.PagPCaP1a在體外進行LLPS

內在無序區域（IDRs）在進行LLPS的蛋白質中很常見，介導生物分子凝聚物的形成。生物信息學分析表明，PagPCaP1a很可能含有IDRs（圖4A）。在室溫下在有或沒有NaCl的情況下孵育純化的重組PagPCaP1a-GFP，沒有任何樣本顯示出蛋白質溶液的濁度。在反應中加入了CaCl2形式的Ca²⁺產生了指示LLPS的濁溶液（圖4B）。為了確認Ca²⁺在PagPCaP1a相分離中的作用，在存在NaCl或CaCl2的情況下進行沉淀實驗，通過離心分離可溶部分和凝聚相（沉淀），隨后進行SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色，確定了加入Ca²⁺促進了PagPCaP1a-GFP凝聚相（沉淀）的形成（圖4C）。對濁溶液的顯微鏡觀察顯示，PagPCaP1a-GFP/-mCherry形成微米級的凝聚物（圖4D）。

體外相分離實驗通過系統地改變Ca²⁺和重組PagPCaP1a-GFP的濃度來生成相圖，以評估促進凝聚物形成的條件（圖4E）。隨著Ca²⁺（0到10 mM）或蛋白質（5到150 μM）濃度的增加，形成的凝聚物更大且數量更多（圖4，F到H）。使用時間序列顯微鏡觀察到單個PagPCaP1a凝聚物的融合，形成了更大和更球形的蛋白質體（圖4I）。FRAP實驗顯示，漂白后的PagPCaP1a-GFP凝聚物的熒光信號在90秒內恢復到接近光漂白前的值（圖4，J和K）。這些結果表明，PagPCaP1a-GFP凝聚物具有LLPS所必需的動態特性。

圖4 PagPCaP1a在體外進行LLPS

5.PagPCaP1a通過其VEEEKK基序部分以依賴Ca²⁺的方式進行LLPS

VEExK基序是一個潛在的Ca²⁺結合位點，并且對擬南芥中Ca²⁺介導的PCaP1功能至關重要。作者突變了VEEEKK基序中的三個氨基酸，創建了mPagPCaP1a變體（圖5A）。在體內的相分離實驗中，將PagPCaP1a-mCherry或mPagPCaP1a-mCherry構建體浸潤到N. benthamiana細胞中，發現PagPCaP1a-mCherry和mPagPCaP1a-mCherry在對照條件下均定位在質膜上。然而，在暴露于鹽脅迫時，PagPCaP1a-mCherry形成了可見的凝聚物，而mPagPCaP1a-mCherry則沒有（圖5B）。進一步通過在Pagpcap1a突變體楊樹獲得的原生質體中瞬時表達proPagPCaP1:mPagPCaP1a-GFP或proPagPCaP1:mPagPCaP1a-mCherry來確認這些結果（圖5C）。

此外，將proAtPCaP1:mPagPCaP1a-GFP轉基因引入到擬南芥pcap1突變體背景中（指定為mCom#1和mCom#2）。在mCom#1和mCom#2幼苗的根細胞中，即使在鹽處理條件下，mPagPCaP1a-GFP仍保持其質膜定位（圖5D），這與在楊樹細胞中的觀察結果一致。此外，proAtPCaP1:mPagPCaP1a-GFP無法補償擬南芥pcap1突變體在鹽分壓力下更高存活率的表型（圖5，E和F）。這些發現揭示了依賴Ca²⁺的相分離對于PagPCaP1a蛋白在幼苗響應鹽分壓力時的功能至關重要。

為了研究VEEEKK基序在PagPCaP1a相分離中的重要作用，作者檢測了mPagPCaP1a在體外的相分離。在相同濃度的Ca²⁺存在下，mPagPCaP1a的濁度與PagPCaP1a相比顯著降低（圖5，G和H）。對溶液的顯微鏡觀察顯示，mPagPCaP1a只能形成散亂的、不規則形狀的聚集體，因此其相分離能力大大降低（圖5，I至K），證實了Ca²⁺對PagPCaP1a相分離的重要作用。

圖5 VEEEKK基序對Ca²⁺介導的PagPCaP1a相分離至關重要

6.PagPCaP1a凝聚物在鹽脅迫下增強微管解聚的效率

由于PagPCaP1a在鹽脅迫下使微管不穩定并形成蛋白質凝聚物，因此作者研究了PagPCaP1a凝聚物存在下微管的行為。PagPCaP1a-mCherry和MBD-GFP在本氏煙草細胞中瞬時共表達。共聚焦顯微鏡顯示，當細胞暴露于200 mM NaCl時，大多數PagPCaP1a-mCherry凝聚物與微管共定位（圖6A）。為了證實這些結果，進一步培養了共表達PagPCaP1a-GFP和mCherry微管蛋白的轉基因擬南芥植物。在這些植物中，PagPCaP1a-GFP凝聚物與mCherry微管蛋白標記的皮質微管共定位，特別是在用NaCl處理的細胞中（圖6B）。因此，PagPCaP1a凝聚物在鹽脅迫下定位于微管。

接下來，研究了PagPCaP1a凝聚物對微管組織的影響，方法是使用由羅丹明標記的微管蛋白聚合的微管，并將其與重組純化的His-PagPCaP1a或His-mPagPCaP1a一起孵育。在沒有Ca²⁺的情況下，與對照相比，PagPCaP1a或mPagPCaP1a的存在下微管的密度降低，PagPCaP1a和mPagPCaP1a之間沒有顯著差異。在Ca²⁺存在的情況下，PagPCaP1a存在下的微管密度顯著低于mPagPCaP1a存在下的微管密度（圖6C）。微管密度的量化表明，PagPCaP1a凝聚物在Ca²⁺存在下可以加速微管解聚約兩倍，與沒有Ca²⁺且沒有相分離的條件相比（圖6D），這表明PagPCaP1a的LLPS加速了微管解聚。總之，這些結果表明，鹽分壓力誘導PagPCaP1a的LLPS，這些凝聚物定位到微管上以促進其解聚，從而影響植物的鹽耐受性。

圖6 PagPCaP1a凝聚物在鹽脅迫下增強微管解聚的效率