研究對(duì)象：臨床BD患者和健康對(duì)照血清、PBMC、PMN，小鼠

技術(shù)方法：代謝組、脂質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、炎癥因子檢測(cè)、基因敲除小鼠構(gòu)建、免疫熒光染色等

技術(shù)路線：

1.多組學(xué)分析強(qiáng)調(diào)了 MVA 通路在 BD-PMN 過(guò)度激活中的促炎作用

作者整合了已發(fā)表的多組學(xué)的數(shù)據(jù)，包括BD患者和健康對(duì)照的血清代謝組，脂質(zhì)組，PBMC和PMN的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，PBMC的單細(xì)胞RNA測(cè)序。結(jié)果表明，與HC相比，BD血清中的類固醇生物合成途徑顯著上調(diào)（圖1A）,單個(gè)免疫群的分析結(jié)果顯示，血清中的這種代謝改變主要發(fā)生在BD-PMN中（圖1B）。類固醇的下游通路中，BD-PMN 的膽固醇生物合成途徑顯著增加，但膽汁酸和類固醇激素的合成途徑卻沒(méi)有增加（圖1C）。隨后，作者從BD-PMN和HC-PMN的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)檢查了膽固醇生物合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)譜，并在獨(dú)立的20例BD患者隊(duì)列中通過(guò)qRT-PCR的方法進(jìn)行了驗(yàn)證（圖1D），結(jié)果顯示，表達(dá)差異最大的酶，包括ACAT1、MVK、PMVK 和MVD，都集中在膽固醇生物合成的上游途徑，即 MVA 途徑（圖1E）。

這些結(jié)果表明，BD-PMN 中的 MVA 通路發(fā)生了特異性上調(diào)。

圖1 多組學(xué)分析凸顯了BD患者中MVA途徑的上調(diào)

為了確定MVA通路的作用，作者通過(guò)使用辛伐他汀和唑來(lái)膦酸分別抑制了控制 MVA 通路起點(diǎn)和終點(diǎn)的酶（圖1E），結(jié)果顯示兩種抑制劑都能抑制BD-PMN的促炎細(xì)胞因子（圖2A-B）。MVA 通路的最終產(chǎn)物是法尼基焦磷酸（FPP），由GPP轉(zhuǎn)化而來(lái)，作者推測(cè)FPP可能是參與MVA通路誘導(dǎo)BD-PMN超活化的主要成分。為了驗(yàn)證該假設(shè)，作者分別抑制和激活了通路關(guān)鍵酶角鯊烯合成酶（FDFT1）的功能，結(jié)果表明，F(xiàn)PP在細(xì)胞內(nèi)的積累增加了BD-PMN中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，反之亦然（圖2C-E），且對(duì)PMN的活力無(wú)影響，這表明 FPP 在 PMN 中具有促炎作用。

這些結(jié)果表明，MVA通路，尤其是其代謝產(chǎn)物 FPP，在PMN活化和炎癥中起著促炎作用。

圖2 FPP是BD-FMN炎癥中的關(guān)鍵代謝物

2.BD患者的FPP水平升高且與疾病活動(dòng)相關(guān)

作者通過(guò)靶向代謝的方法進(jìn)一步檢測(cè)了FPP在血清和PMN樣本中的豐度，與HC相比，活動(dòng)性BD患者的兩種樣本中的FPP相對(duì)水平均升高（圖2F），縱向隨訪數(shù)據(jù)表明，在BD患者有所緩解后，PMN和血清中的FPP水平顯著下降（圖2G-H）。臨床數(shù)據(jù)的評(píng)估結(jié)果顯示，PMN中的FPP水平與C反應(yīng)蛋白（CRP）呈正相關(guān)，而血清中的FPP水平則與CRP和紅細(xì)胞沉降率（ESR，BD疾病活動(dòng)性的指標(biāo)）均呈正相關(guān)（圖2I，J），活動(dòng)性高的患者樣本中的FPP水平顯著高于低活動(dòng)性的患者，具有心外血管受累（包括深靜脈血栓和動(dòng)脈瘤）的BD患者的血清FPP水平明顯高于心臟受累患者。ROC曲線的結(jié)果中，F(xiàn)PP的AUC值為0.7467。

這些結(jié)果暗示了FPP刺激下DAMPs介導(dǎo)的PMN炎癥和壞死的直接效應(yīng)。

3.BD-PMN對(duì)外源FPP的增強(qiáng)反應(yīng)性促進(jìn)了PMN的過(guò)度激活及血管內(nèi)皮的炎癥和損傷

作者在體外化學(xué)合成了FPP，并研究了其對(duì)PMN、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響，數(shù)據(jù)顯示，PMN中促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，但淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞無(wú)影響，且D-PMN的反應(yīng)性高于HC-PMN（圖3A-D）。在FPP以劑量依賴的方式刺激了PMN中促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生（圖3E），且未影響其存活率，隨著濃度增加，60 μg/mL FPP誘導(dǎo)了PMN、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的死亡，且BD患者PMN中的反應(yīng)性更強(qiáng)（圖3F-H）。與CRP正相關(guān)的NETs來(lái)源的dsDNA，在活動(dòng)性BD患者中也顯著高于HC組（圖3I），隨訪結(jié)果表明，治療后緩解期的BD患者血清NETs-dsDNA水平顯著下降（圖3J）。此外，60 μg/mL FPP刺激的BD-PMN上清液比HC的上清液引起了血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的更強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為促炎性細(xì)胞因子和黏附分子的上調(diào)（圖3K）。

這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)PP特異性觸發(fā)PMN過(guò)度激活和VEC炎癥，并增強(qiáng)BD-PMN的反應(yīng)性。

圖3 FPP對(duì)PMN過(guò)度激活和血管內(nèi)皮炎癥的影響

4.鈣和TRP通道對(duì)于FPP誘導(dǎo)的PMN激活至關(guān)重要

FPP通過(guò)與瞬時(shí)受體電位（TRP）通道相互作用引發(fā)鈣離子內(nèi)流，進(jìn)而引起基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞免疫反應(yīng)。為了驗(yàn)證鈣離子的作用，作者在存在和不存在鈣的情況下使用了通用抑制劑紅釕（RR），這兩種條件均抑制了FPP誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流、細(xì)胞因子產(chǎn)生（圖4A）和PMN的NETosis（圖4B-D），這表明鈣和TRP通道對(duì)FPP促進(jìn)PMN過(guò)度激活至關(guān)重要。此外，RR顯著減弱了FPP對(duì)NETosis誘導(dǎo)的VEC激活的影響（圖4E）。NETs-dsDNA降解后，VEC中促炎性細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)顯著降低（圖4C、E），這表明NETs是FPP刺激PMN上清液中誘導(dǎo)VEC炎癥的關(guān)鍵成分。TRP通道介導(dǎo)了BD-PMN對(duì)FPP刺激的增強(qiáng)反應(yīng)（圖4F、G）。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示，在FPP刺激下，BD-PMN比HC-PMN表現(xiàn)出更強(qiáng)的鈣離子內(nèi)流（圖4H）。

這些結(jié)果表明，F(xiàn)PP誘導(dǎo)的PMN活化機(jī)制依賴于通過(guò)TRP通道的鈣離子內(nèi)流。

圖4 FPP對(duì)FMN的促炎作用依賴于鈣和TRP通道

5.TNF-TRPM2軸在PMN中引發(fā)了FFP誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的RR敏感鈣通道（TRP通道等）分析結(jié)果表明，四個(gè)基因（TRPM2、TRPC1、RYR1和MCOLN2）的表達(dá)顯著升高（圖5A），根據(jù)qRT-PCR和WB的結(jié)果（圖5B-C），TRPM2是BD-PMN中FPP反應(yīng)性增強(qiáng)的主要原因，且TRPM2的表達(dá)水平在活動(dòng)期BD患者中顯著高于緩解期（圖5D），這暗示TRPM2可能參與BD的進(jìn)展。BD-PMN中TRPM2的敲低顯著改善了FPP誘導(dǎo)的BD-PMN過(guò)度激活，表現(xiàn)為促炎性細(xì)胞因子（圖5E）、NETs（圖5F-H）和VEC的炎癥反應(yīng)的降低（圖5I）。

圖5 TRPM2 表達(dá)升高參與了 FPP 誘導(dǎo)的 BD-PMN 炎癥反應(yīng)

使用活動(dòng)期BD血清培養(yǎng)的HC-PMN的TRPM2表達(dá)水平顯著高于使用HC血清培養(yǎng)的HC-PMN（圖6A），促炎因子的結(jié)果中，BD血清中的TNF、IL-6和IFN-γ水平高于HC血清（圖6B）。這些數(shù)據(jù)表明，只有TNF顯著增加了PMN上的TRPM2表達(dá)（圖6C-D），而其他細(xì)胞因子如IL-6、IL-18、IL-1β或IFN-γ則沒(méi)有影響。

臨床數(shù)據(jù)中，經(jīng)過(guò)4個(gè)月左右的TNF抑制劑治療，BD-PMN中的TRPM2表達(dá)顯著降低（圖6E），隨訪數(shù)據(jù)也表明，最后檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的BD-PMN中，TRPM2表達(dá)顯著低于基線水平。此外，體外實(shí)驗(yàn)表明，TNF抑制在BD血清中減少了FPP誘導(dǎo)的PMN活化（圖6F-G）。

這些數(shù)據(jù)表明，TNF抑制劑的治療可以通過(guò)下調(diào)BD-PMN中TRPM2的表達(dá)，減少FPP誘導(dǎo)的PMN活化。

圖6 TNF-TRPM2軸在BD-PMN中引發(fā)FPP誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

6.FPP-TRPM2-PMN軸參與小鼠血管炎和自身免疫性葡萄膜炎

為了進(jìn)一步確認(rèn)FPP在血管炎癥和損傷中的關(guān)鍵作用，作者構(gòu)建了FPP合成酶（FPPS）敲除小鼠，并誘導(dǎo)了血管炎癥。與對(duì)照組相比，敲除鼠的血管炎癥和損傷降低，表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和血管通透性顯著降低（圖7A-D），敲除鼠皮膚組織中MPO陽(yáng)性細(xì)胞的比例也明顯低于對(duì)照小鼠（圖7E-H）。此外，TRPM2全敲除（TRPM2-KO）小鼠與野生型對(duì)照小鼠相比，也表現(xiàn)出顯著降低的血管損傷，血管通透性降低（圖7I-K）。

這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)PP-TRPM2-PMN軸在誘導(dǎo)血管炎癥中的關(guān)鍵作用。

圖7 FPPS和TRPM2敲除可有效減輕小鼠的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和血管通透性