研究對象：臨床BD患者和健康對照血清、PBMC、PMN，小鼠

技術方法：代謝組、脂質組、轉錄組、單細胞轉錄組、炎癥因子檢測、基因敲除小鼠構建、免疫熒光染色等

技術路線：

1.多組學分析強調了 MVA 通路在 BD-PMN 過度激活中的促炎作用

作者整合了已發表的多組學的數據，包括BD患者和健康對照的血清代謝組，脂質組，PBMC和PMN的轉錄組測序，PBMC的單細胞RNA測序。結果表明，與HC相比，BD血清中的類固醇生物合成途徑顯著上調（圖1A）,單個免疫群的分析結果顯示，血清中的這種代謝改變主要發生在BD-PMN中（圖1B）。類固醇的下游通路中，BD-PMN 的膽固醇生物合成途徑顯著增加，但膽汁酸和類固醇激素的合成途徑卻沒有增加（圖1C）。隨后，作者從BD-PMN和HC-PMN的轉錄數據檢查了膽固醇生物合成途徑中關鍵酶的表達譜，并在獨立的20例BD患者隊列中通過qRT-PCR的方法進行了驗證（圖1D），結果顯示，表達差異最大的酶，包括ACAT1、MVK、PMVK 和MVD，都集中在膽固醇生物合成的上游途徑，即 MVA 途徑（圖1E）。

這些結果表明，BD-PMN 中的 MVA 通路發生了特異性上調。

圖1 多組學分析凸顯了BD患者中MVA途徑的上調

為了確定MVA通路的作用，作者通過使用辛伐他汀和唑來膦酸分別抑制了控制 MVA 通路起點和終點的酶（圖1E），結果顯示兩種抑制劑都能抑制BD-PMN的促炎細胞因子（圖2A-B）。MVA 通路的最終產物是法尼基焦磷酸（FPP），由GPP轉化而來，作者推測FPP可能是參與MVA通路誘導BD-PMN超活化的主要成分。為了驗證該假設，作者分別抑制和激活了通路關鍵酶角鯊烯合成酶（FDFT1）的功能，結果表明，FPP在細胞內的積累增加了BD-PMN中促炎細胞因子的產生，反之亦然（圖2C-E），且對PMN的活力無影響，這表明 FPP 在 PMN 中具有促炎作用。

這些結果表明，MVA通路，尤其是其代謝產物 FPP，在PMN活化和炎癥中起著促炎作用。

圖2 FPP是BD-FMN炎癥中的關鍵代謝物

2.BD患者的FPP水平升高且與疾病活動相關

作者通過靶向代謝的方法進一步檢測了FPP在血清和PMN樣本中的豐度，與HC相比，活動性BD患者的兩種樣本中的FPP相對水平均升高（圖2F），縱向隨訪數據表明，在BD患者有所緩解后，PMN和血清中的FPP水平顯著下降（圖2G-H）。臨床數據的評估結果顯示，PMN中的FPP水平與C反應蛋白（CRP）呈正相關，而血清中的FPP水平則與CRP和紅細胞沉降率（ESR，BD疾病活動性的指標）均呈正相關（圖2I，J），活動性高的患者樣本中的FPP水平顯著高于低活動性的患者，具有心外血管受累（包括深靜脈血栓和動脈瘤）的BD患者的血清FPP水平明顯高于心臟受累患者。ROC曲線的結果中，FPP的AUC值為0.7467。

這些結果暗示了FPP刺激下DAMPs介導的PMN炎癥和壞死的直接效應。

3.BD-PMN對外源FPP的增強反應性促進了PMN的過度激活及血管內皮的炎癥和損傷

作者在體外化學合成了FPP，并研究了其對PMN、淋巴細胞和單核細胞的促炎性細胞因子表達的影響，數據顯示，PMN中促炎性細胞因子的產生增加，但淋巴細胞和單核細胞無影響，且D-PMN的反應性高于HC-PMN（圖3A-D）。在FPP以劑量依賴的方式刺激了PMN中促炎性細胞因子的產生（圖3E），且未影響其存活率，隨著濃度增加，60 μg/mL FPP誘導了PMN、單核細胞和淋巴細胞的死亡，且BD患者PMN中的反應性更強（圖3F-H）。與CRP正相關的NETs來源的dsDNA，在活動性BD患者中也顯著高于HC組（圖3I），隨訪結果表明，治療后緩解期的BD患者血清NETs-dsDNA水平顯著下降（圖3J）。此外，60 μg/mL FPP刺激的BD-PMN上清液比HC的上清液引起了血管內皮細胞（VEC）的更強烈炎癥反應，表現為促炎性細胞因子和黏附分子的上調（圖3K）。

這些數據表明，FPP特異性觸發PMN過度激活和VEC炎癥，并增強BD-PMN的反應性。

圖3 FPP對PMN過度激活和血管內皮炎癥的影響

4.鈣和TRP通道對于FPP誘導的PMN激活至關重要

FPP通過與瞬時受體電位（TRP）通道相互作用引發鈣離子內流，進而引起基因轉錄和細胞免疫反應。為了驗證鈣離子的作用，作者在存在和不存在鈣的情況下使用了通用抑制劑紅釕（RR），這兩種條件均抑制了FPP誘導的鈣內流、細胞因子產生（圖4A）和PMN的NETosis（圖4B-D），這表明鈣和TRP通道對FPP促進PMN過度激活至關重要。此外，RR顯著減弱了FPP對NETosis誘導的VEC激活的影響（圖4E）。NETs-dsDNA降解后，VEC中促炎性細胞因子和黏附分子的表達顯著降低（圖4C、E），這表明NETs是FPP刺激PMN上清液中誘導VEC炎癥的關鍵成分。TRP通道介導了BD-PMN對FPP刺激的增強反應（圖4F、G）。流式細胞術的結果顯示，在FPP刺激下，BD-PMN比HC-PMN表現出更強的鈣離子內流（圖4H）。

這些結果表明，FPP誘導的PMN活化機制依賴于通過TRP通道的鈣離子內流。

圖4 FPP對FMN的促炎作用依賴于鈣和TRP通道

5.TNF-TRPM2軸在PMN中引發了FFP誘導的炎癥反應

RNA測序數據庫中的RR敏感鈣通道（TRP通道等）分析結果表明，四個基因（TRPM2、TRPC1、RYR1和MCOLN2）的表達顯著升高（圖5A），根據qRT-PCR和WB的結果（圖5B-C），TRPM2是BD-PMN中FPP反應性增強的主要原因，且TRPM2的表達水平在活動期BD患者中顯著高于緩解期（圖5D），這暗示TRPM2可能參與BD的進展。BD-PMN中TRPM2的敲低顯著改善了FPP誘導的BD-PMN過度激活，表現為促炎性細胞因子（圖5E）、NETs（圖5F-H）和VEC的炎癥反應的降低（圖5I）。

圖5 TRPM2 表達升高參與了 FPP 誘導的 BD-PMN 炎癥反應

使用活動期BD血清培養的HC-PMN的TRPM2表達水平顯著高于使用HC血清培養的HC-PMN（圖6A），促炎因子的結果中，BD血清中的TNF、IL-6和IFN-γ水平高于HC血清（圖6B）。這些數據表明，只有TNF顯著增加了PMN上的TRPM2表達（圖6C-D），而其他細胞因子如IL-6、IL-18、IL-1β或IFN-γ則沒有影響。

臨床數據中，經過4個月左右的TNF抑制劑治療，BD-PMN中的TRPM2表達顯著降低（圖6E），隨訪數據也表明，最后檢測時間點的BD-PMN中，TRPM2表達顯著低于基線水平。此外，體外實驗表明，TNF抑制在BD血清中減少了FPP誘導的PMN活化（圖6F-G）。

這些數據表明，TNF抑制劑的治療可以通過下調BD-PMN中TRPM2的表達，減少FPP誘導的PMN活化。

圖6 TNF-TRPM2軸在BD-PMN中引發FPP誘導的炎癥反應

6.FPP-TRPM2-PMN軸參與小鼠血管炎和自身免疫性葡萄膜炎

為了進一步確認FPP在血管炎癥和損傷中的關鍵作用，作者構建了FPP合成酶（FPPS）敲除小鼠，并誘導了血管炎癥。與對照組相比，敲除鼠的血管炎癥和損傷降低，表現為中性粒細胞浸潤和血管通透性顯著降低（圖7A-D），敲除鼠皮膚組織中MPO陽性細胞的比例也明顯低于對照小鼠（圖7E-H）。此外，TRPM2全敲除（TRPM2-KO）小鼠與野生型對照小鼠相比，也表現出顯著降低的血管損傷，血管通透性降低（圖7I-K）。

這些實驗結果表明，FPP-TRPM2-PMN軸在誘導血管炎癥中的關鍵作用。

圖7 FPPS和TRPM2敲除可有效減輕小鼠的中性粒細胞浸潤和血管通透性