研究材料：醋炙柴胡、Huh 7（人肝癌細胞）、HepG2細胞、Bel7402細胞

技術方法：分子量、單糖組成、紫外和紅外光譜、甲基化分析、核磁光譜、剛果紅實驗、細胞活力測定

技術路線：

實驗思路圖

1.醋炙柴胡中分離出三種多糖

分離純化后，VRP3-3、VRP2-3和VRP2-4的產率分別為2.95 %、6.80 %、13.19 %（圖1 A和B)。紫外光譜圖(圖1 C~E)顯示VRPs中含有微量的蛋白質或核酸。三種多糖在SEC色譜圖中分別顯示出單一的對稱峰(圖2）這表明它們是均一的多糖。VRP3-3、VRP2-3和VRP2-4的分子量分別為16.05 kDa、95.35 kDa和57.90 kDa。VRP3-3和VRP2-3主要由阿拉伯糖和半乳糖組成，VRP2-4主要由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖組成。

圖1 多糖在DEAE纖維素52柱上的洗脫曲線及其紫外掃描。VRP2 (A)和VRP3 (B)的洗脫曲線；對VRP3-3 (C)、VRP2-3 (D)和VRP2-4 (E)進行紫外掃描

圖2 VRP3-3、VRP2-3、VRP2-4的SEC (A~C)和FT-IR (D~F)譜圖

2.紅外光譜分析

紅外光譜結果如圖2所示，推測VRP3-3和VRP2-3為β-呋喃多糖，VRP2-4為β-吡喃酸多糖。

3.甲基化分析

甲基化結果如表1所示，根據甲基化分析的結果，在VRP3-3中鑒定了8個pmaa，在VRP2-3中鑒定了10個pmaa，在VRP 2-4中鑒定了7個pmaa，支化度分別為41.49 %、53.77 %和33.32 %。結果表明，t-Araf、1，5-Araf、1，3，5-Araf和1，4-Galp殘基是VRP中普遍存在的連接，并且都是高度分支的多糖。

表1 VRPs的甲基化結果

4.核磁共振分析

VRP3-3被認為是高度分支的多糖，其特征以→1)-α-Araf-(5→,→1，2)-α-Rhap (4→和→1)-α-GalpA(4→為主鏈，帶有少量的酯化和乙酰化基團，并且一些側鏈連接Araf的O-3，Rhap的O-4（圖3）；VRP2-3的主鏈為→1)- α-Galp(2→，→1)-β-GalpA(O-Ac)(4→，1，2)-α-Rhap-(4→，→1)-α-Araf-(5→和一些末端片段，包括t-α-Araf和t-β-Galp。側鏈主要由1，4-β-Galp、1，3-β-Galp和1，6-β-D-Galp組成，分別連接在α-L-Rhap的O-4和α-L-Araf的O-3位（圖4）。VRP2-4的骨架由以下部分組成→1)-α-Galp-(4→，1)-α-GalpA (OMe)-(4→，→1)-α-GalpA-(4→ and →1，2)- α-Rhap (4→,半乳糖醛酸殘基上發生乙酰化。作為主要的側鏈，→5)-α-Araf-(1→連接在α-Rhap的O-4位，還包括少量的t-α-Galp和t-α-Manp（圖5）。

圖3  VRP3-3核磁共振結果

圖4  VRP2-3核磁共振結果

圖5  VRP2-4核磁共振結果

5.高級結構分析

剛果紅結果如圖6所示，VRP2-3和VRP2-4沒有三股螺旋結構，而剛果紅+VRP3-3溶液中的λmax隨著堿濃度的增加而顯著移動，表明VRP3-3具有三股螺旋結構。

圖6 高級結構

6.化療藥物以劑量依賴的方式抑制HCC細胞的增殖

紫杉醇(PTX)、甲氨蝶呤(MTX)和順鉑(DDP)對Huh7細胞的48小時抑制作用如圖7，隨著濃度的增加，抑制率相應增加。

7.VRPs顯著增強化療藥物對HCC細胞增殖的抑制作用

在三種多糖中，VRP3-3與PTX、MTX和順鉑聯合應用對Huh7細胞的協同作用最好，q值分別為1.40、1.16、1.83(圖7 J-M)。

圖7  多糖和化療藥物對肝癌細胞抑制率的體外聯合作用

8.VRPs的結構組合效應關系分析

選擇三種化療藥物與三種VRP聯合應用，其中VRP3-3的增效作用最好，其次是VRP2-3，VRP2-4的增效作用最弱。同一來源的多糖活性差異很大，表明多糖的結構與其聯合作用直接相關。目前已證明多糖的分子量、主鏈組成、側鏈長度和高級結構與其活性密切相關。在這三種多糖中，VRP3-3的分子量較小，半乳糖醛酸含量較少，阿拉伯糖含量較高。相關性分析(圖8)顯示阿拉伯糖和葡萄糖的比例與結合活性呈正相關。與溶液中形成的多糖的粒徑呈一定的正相關關系。甘露糖、鼠李糖和半乳糖醛酸似乎與組合活性負相關。而半乳糖對組合活性貢獻很小。通過對三種多糖主鏈和側鏈糖苷鍵類型的比較分析，我們發現了一些有價值的結構差。VRP3-3的主鏈主要由1，5連接的α-Araf組成，還有一小部分1，2，4連接的α-Rhap和1，4連接的α-GalpA。VRP2-3的骨架也由超過一半的1，5連接的-α-Araf，部分1，2連接的-α-Galp，1，4連接的-β-GalpA(O-Ac)和1，2，4連接的-α-Rhap組成。VRP2-4的主鏈主要由1，4連接的α-Galp、1，4連接的α-GalpA(OMe)、1，4連接的α-GalpA和1，2，4連接的α-Rhap組成。VRP3-3的側鏈主要由1，6- β-Galp和1，3-β-Galp組成，VRP2-3主要由1，4-β-Galp、1，6-β-Galp和1，3-β-Galp組成，VRP2-4以1，5-連接的α-Araf為特征。有趣的是，VRP3-3具有三螺旋結構，而其他兩種多糖沒有。一般來說，中等分子量和三螺旋結構的多糖具有較好的生物活性。綜上所述，我們可以初步推斷，分子量約為16 kDa、主鏈中阿拉伯聚糖聚合度較大且具有三螺旋結構的VRP具有較好的結合活性。在三種多糖中，VRP3-3與PTX、MTX和順鉑聯合應用對Huh7細胞的協同作用最好，q值分別為1.40、1.16、1.83(圖7 J-M)。

圖8 多糖結構與綜合活性的相關性分析