肝纖維化是多種肝病的最終階段，抑制肝星狀細胞(HSC)的激活對限制肝病纖維化至關重要。盡管對HSC激活機制的理解有所進步，但治療纖維化的方案仍然有限。Gal-3是一個重要的治療靶點，因為它能激活HSC。果膠是一種植物多糖，其中的RG-I阿拉伯半乳聚糖(AG)側鏈有可能被Gal-3識別。Belapectin (GR-MD-02)是一種AG樣果膠，正在進行3期臨床試驗以評估其抗肝纖維化作用，但目前僅通過靜脈注射，口服效果未知。為了滿足口服治療的需求，研究者正在尋找其他Gal-3抑制劑。藏紅花是一種昂貴的香料和草藥，傳統上用于治療多種疾病，包括肝病。藏紅花水提取物能減輕小鼠肝纖維化，但其多糖成分研究較少。
2024年10月，中國科學院上海藥物研究所臧奕/丁侃/李佳，復旦大學藥學院張雪梅團隊在Carbohydrate Polymers發表題目為“A novelpectin-like polysaccharide from Crocus sativus targets Galectin-3 to inhibithepatic stellate cells activation and liver fibrosis”的研究論文，從藏紅花中分離純化得到一種具有抑制肝纖維化活性的果膠多糖（XHH2），并利用甲基化分析、部分酸水解、質譜和核磁共振譜等方法對其結構進行了表征。通過多肝星狀細胞活化模型和四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化小鼠模型評價其抗纖維化作用。
研究材料：藏紅花
技術方法：分子量分析、單糖組成分析、甲基化分析、核磁分析、糖醛酸還原、部分酸水解、多肝星狀細胞活化模型、四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化小鼠模型
技術路線：
1.藏紅花XHH2的分離與純度分析
從藏紅花干花中分離出名為XHH2的均質多糖，產率為0.123%，純度達93.54%。通過高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）分析，得知XHH2的數均分子量、重均分子量和z均分子量分別為30.6 kDa、35.7 kDa和40.3 kDa，多分散指數為1.1661。單糖組成分析顯示，XHH2由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖按特定摩爾比組成。
圖1 藏紅花中XHH2的分離純化方案
2.藏紅花XHH2的結構表征
使用化學和光譜分析方法對XHH2進行結構表征，確定了其糖苷連鎖模式和糖殘基的連鎖序列。根據表2，XHH2中的Ara以兩種模式連接：T-Ara和1,5 -Ara。鼠李糖殘基是1,2,4 -連接的Rha，而半乳糖則表現出多種連接，包括t-Gal、1,4 -Gal、1,3 -Gal、1,6 -Gal和1,3,6 -Gal。還原后，1,2,4 -Rha的水平在RXHH2和RXHH2I中都有明顯的上升。這種增加被認為是源于原始XHH2多糖中1,2,4 - Rha的不完全甲基化，它與GalA連接。
通過核磁共振技術確定了XHH2和XHH2I糖殘基的鍵型H-2向H-6和C-2向C-6的化學位移。對應的位移分別列在表3和表4中。結果顯示，XHH2的主鏈和分支由特定的糖殘基組成，具有復雜的結構特征。
圖2 XHH2和XHH2I的1D和2D NMR譜。A. XHH2和XHH2I的13C NMR。B.XHH2和XHH2I的HSQC譜。C.XHH2和XHH2I的HMBC譜（紅線：XHH2，藍線：XHH2）
圖3 XHH2重復單元的結構示意圖
3.XHH2抑制TGF-β誘導的HSC活化
細胞實驗表明，XHH2能顯著降低HSC的代表性標志物水平，并抑制TGF-β誘導的HSC遷移和侵襲。這些結果表明XHH2具有抑制TGF-β誘導的HSC活化的能力。
圖4 XHH2限制TGF-β誘導的肝星狀細胞活化
4.XHH2抑制原代小鼠HSC的自激活
在正常和病理狀態下分離的原代小鼠HSC實驗中，XHH2均能劑量依賴性地抑制HSC的自激活。這些結果進一步證實了XHH2抑制HSC活化的能力。
圖5 XHH2抑制原代小鼠肝星狀細胞活化
5.XHH2通過Gal-3/integrin-β1/FAK途徑抑制HSC活化
研究發現，XHH2容易與Gal-3結合，并通過干擾Gal-3與Integrin β1之間的互作來抑制HSC活化。進一步探索發現，Integrin β1/FAK信號通路參與了XHH2對HSC活化的抑制作用。
圖6 XHH2通過Gal-3/Integrin-β1/FAK通路抑制HSC的活化
6.XHH2保護小鼠肝臟免受CCL4誘導的肝損傷和肝纖維化
急性毒性研究表明XHH2具有低毒性，可進一步進行藥理評價。在CCL4誘導的肝纖維化模型中，XHH2改善了小鼠的肝損傷，減少了ECM的沉積，抑制了HSC的活化，從而減輕了肝纖維化。綜上所述，XHH2具有顯著的抗肝纖維化作用。
圖7 XHH2對四氯化碳誘導的肝損傷和纖維化的影響
作者首次從藏紅花中分離純化出果膠樣多糖XHH2。XHH2結構獨特，主鏈由1,3,6-Gal和1,3,4-GalA組成，O-3和O-4位置有分支，且含半乳聚糖而非典型RG-I果膠的AG分支，可能對Gal-3有潛在親和力。功能上，XHH2能強效抑制Gal-3、HSC活化和肝纖維化，體內2mg/kg劑量即有效，且小鼠急性毒性試驗表明其高達500mg/kg劑量下安全。與其他Gal-3抑制劑相比，XHH2具有選擇性和口服療效。研究還揭示了Gal-3與整合素-β1相互作用的新機制，闡明了HSC中下游FAK信號調節，強調了XHH2作為抗肝纖維化活性成分的潛力，可作為經典藥物治療的補充。
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