文獻(xiàn)解讀 | IF 10.7/Q1多糖文章！中國科學(xué)院上海藥物研究所聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)團(tuán)隊解析藏紅花抑制肝纖維化效用機制
肝纖維化是多種肝病的最終階段，抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活對限制肝病纖維化至關(guān)重要。盡管對HSC激活機制的理解有所進(jìn)步，但治療纖維化的方案仍然有限。Gal-3是一個重要的治療靶點，因為它能激活HSC。果膠是一種植物多糖，其中的RG-I阿拉伯半乳聚糖(AG)側(cè)鏈有可能被Gal-3識別。Belapectin (GR-MD-02)是一種AG樣果膠，正在進(jìn)行3期臨床試驗以評估其抗肝纖維化作用，但目前僅通過靜脈注射，口服效果未知。為了滿足口服治療的需求，研究者正在尋找其他Gal-3抑制劑。藏紅花是一種昂貴的香料和草藥，傳統(tǒng)上用于治療多種疾病，包括肝病。藏紅花水提取物能減輕小鼠肝纖維化，但其多糖成分研究較少。
2024年10月，中國科學(xué)院上海藥物研究所臧奕/丁侃/李佳，復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院張雪梅團(tuán)隊在Carbohydrate Polymers發(fā)表題目為“A novelpectin-like polysaccharide from Crocus sativus targets Galectin-3 to inhibithepatic stellate cells activation and liver fibrosis”的研究論文，從藏紅花中分離純化得到一種具有抑制肝纖維化活性的果膠多糖（XHH2），并利用甲基化分析、部分酸水解、質(zhì)譜和核磁共振譜等方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。通過多肝星狀細(xì)胞活化模型和四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型評價其抗纖維化作用。
研究材料：藏紅花
技術(shù)方法：分子量分析、單糖組成分析、甲基化分析、核磁分析、糖醛酸還原、部分酸水解、多肝星狀細(xì)胞活化模型、四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型
技術(shù)路線：
1.藏紅花XHH2的分離與純度分析
從藏紅花干花中分離出名為XHH2的均質(zhì)多糖，產(chǎn)率為0.123%，純度達(dá)93.54%。通過高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）分析，得知XHH2的數(shù)均分子量、重均分子量和z均分子量分別為30.6 kDa、35.7 kDa和40.3 kDa，多分散指數(shù)為1.1661。單糖組成分析顯示，XHH2由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖按特定摩爾比組成。
圖1 藏紅花中XHH2的分離純化方案
2.藏紅花XHH2的結(jié)構(gòu)表征
使用化學(xué)和光譜分析方法對XHH2進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，確定了其糖苷連鎖模式和糖殘基的連鎖序列。根據(jù)表2，XHH2中的Ara以兩種模式連接：T-Ara和1,5 -Ara。鼠李糖殘基是1,2,4 -連接的Rha，而半乳糖則表現(xiàn)出多種連接，包括t-Gal、1,4 -Gal、1,3 -Gal、1,6 -Gal和1,3,6 -Gal。還原后，1,2,4 -Rha的水平在RXHH2和RXHH2I中都有明顯的上升。這種增加被認(rèn)為是源于原始XHH2多糖中1,2,4 - Rha的不完全甲基化，它與GalA連接。
通過核磁共振技術(shù)確定了XHH2和XHH2I糖殘基的鍵型H-2向H-6和C-2向C-6的化學(xué)位移。對應(yīng)的位移分別列在表3和表4中。結(jié)果顯示，XHH2的主鏈和分支由特定的糖殘基組成，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特征。
圖2 XHH2和XHH2I的1D和2D NMR譜。A. XHH2和XHH2I的13C NMR。B.XHH2和XHH2I的HSQC譜。C.XHH2和XHH2I的HMBC譜（紅線：XHH2，藍(lán)線：XHH2）
圖3 XHH2重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)示意圖
3.XHH2抑制TGF-β誘導(dǎo)的HSC活化
細(xì)胞實驗表明，XHH2能顯著降低HSC的代表性標(biāo)志物水平，并抑制TGF-β誘導(dǎo)的HSC遷移和侵襲。這些結(jié)果表明XHH2具有抑制TGF-β誘導(dǎo)的HSC活化的能力。
圖4 XHH2限制TGF-β誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化
4.XHH2抑制原代小鼠HSC的自激活
在正常和病理狀態(tài)下分離的原代小鼠HSC實驗中，XHH2均能劑量依賴性地抑制HSC的自激活。這些結(jié)果進(jìn)一步證實了XHH2抑制HSC活化的能力。
圖5 XHH2抑制原代小鼠肝星狀細(xì)胞活化
5.XHH2通過Gal-3/integrin-β1/FAK途徑抑制HSC活化
研究發(fā)現(xiàn)，XHH2容易與Gal-3結(jié)合，并通過干擾Gal-3與Integrin β1之間的互作來抑制HSC活化。進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)，Integrin β1/FAK信號通路參與了XHH2對HSC活化的抑制作用。
圖6 XHH2通過Gal-3/Integrin-β1/FAK通路抑制HSC的活化
6.XHH2保護(hù)小鼠肝臟免受CCL4誘導(dǎo)的肝損傷和肝纖維化
急性毒性研究表明XHH2具有低毒性，可進(jìn)一步進(jìn)行藥理評價。在CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，XHH2改善了小鼠的肝損傷，減少了ECM的沉積，抑制了HSC的活化，從而減輕了肝纖維化。綜上所述，XHH2具有顯著的抗肝纖維化作用。
圖7 XHH2對四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷和纖維化的影響
作者首次從藏紅花中分離純化出果膠樣多糖XHH2。XHH2結(jié)構(gòu)獨特，主鏈由1,3,6-Gal和1,3,4-GalA組成，O-3和O-4位置有分支，且含半乳聚糖而非典型RG-I果膠的AG分支，可能對Gal-3有潛在親和力。功能上，XHH2能強效抑制Gal-3、HSC活化和肝纖維化，體內(nèi)2mg/kg劑量即有效，且小鼠急性毒性試驗表明其高達(dá)500mg/kg劑量下安全。與其他Gal-3抑制劑相比，XHH2具有選擇性和口服療效。研究還揭示了Gal-3與整合素-β1相互作用的新機制，闡明了HSC中下游FAK信號調(diào)節(jié)，強調(diào)了XHH2作為抗肝纖維化活性成分的潛力，可作為經(jīng)典藥物治療的補充。
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