作者首先使用氟苯尼考處理樣本，隨著抗生素濃度增加，小麥幼苗的長(zhǎng)度、DW和FW均下降，表明氟苯尼考對(duì)小麥生長(zhǎng)有顯著抑制作用（圖1A）。檢測(cè)活性氧相關(guān)物質(zhì)含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)MDA 含量隨濃度呈上升趨勢(shì)，SOD、POD 和 CAT 活性也表現(xiàn)出同樣趨勢(shì)（圖1B-E）。

這些結(jié)果表明，氟苯尼考可誘導(dǎo)小麥幼苗產(chǎn)生氧化脅迫，并不可避免地導(dǎo)致植物細(xì)胞功能失調(diào)。

圖1 氟苯尼考脅迫下小麥幼苗形態(tài)及抗氧化反應(yīng)

由于ROS 會(huì)損傷葉綠體細(xì)胞器，導(dǎo)致葉綠素含量下降，作者隨后檢測(cè)了小麥幼苗的光和參數(shù)。隨著抗生素濃度的增加，光合色素含量（葉綠素 a、葉綠素 b 和類胡蘿卜素）逐漸減少（圖 2A），葉綠素前體（Proto IX、Mg-proto IX 和 Pchlide）的也有同樣的變化（圖 2B），這解釋了小麥葉片逐漸變白的表型。

此外，小麥幼苗的光合速率和呼吸速率隨著濃度的增加而降低（圖2C和2D），小麥葉片顏色由藍(lán)色（健康）變?yōu)榫G色，甚至變?yōu)榧t褐色（嚴(yán)重受損），葉尖嚴(yán)重受損（圖 2E）。作為評(píng)價(jià) PSII 光合效率的最有效參數(shù)之一，Y(II) 值隨著氟苯尼考濃度的增加而降低（圖2F），表明在高氟苯尼考濃度下，PSII受到光能捕獲效率降低的影響。而Y(NPQ) 代表調(diào)節(jié)能量耗散的量子產(chǎn)率，該值越高，植物耗散多余光能和減緩 ROS 生成以進(jìn)行自我保護(hù)的能力越強(qiáng)，表明氟苯尼考可能會(huì)干擾植物耗散多余光能的能力，促進(jìn) ROS 的產(chǎn)生（圖2G），ETR表示PSII在實(shí)際PAR下的電子傳遞效率，ETR值也隨著氟苯尼考濃度的增加而降低（圖2H）。

作者隨后通過透射電子顯微鏡分析了氟苯尼考處理后葉片細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。在對(duì)照組中，細(xì)胞壁清晰，葉綠體呈紡錘形，葉綠體雙層膜完整整齊，葉綠體密度適中且規(guī)則，質(zhì)體極少。核膜和核仁清晰完整（圖3A和B）。氟苯尼考暴露后，葉綠體腫脹變形，膜表面模糊不清，顆粒排列不規(guī)則，類葉綠體片層結(jié)構(gòu)受損，質(zhì)球體的數(shù)量明顯增加，且排列緊密（圖3C和D）。

這些結(jié)果表明電子傳遞過程可能受到抑制，導(dǎo)致 ROS 的積累，并進(jìn)一步造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。

圖2 氟苯尼考對(duì)光合作用的影響

圖3 氟苯尼考對(duì)葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

為了進(jìn)一步了解小麥幼苗對(duì)氟苯尼考的反應(yīng)機(jī)制，作者進(jìn)行了蛋白組檢測(cè)，共鑒定出976個(gè)蛋白，其中上調(diào)蛋白362個(gè)，下調(diào)蛋白134個(gè)。GO分析表明，小麥幼苗的代謝譜（羧酸代謝過程、氧酸代謝過程等）、蛋白質(zhì)的重折疊和翻譯等均有變化，下調(diào)的差異蛋白主要集中在光合作用以及前體代謝物和能量的產(chǎn)生，這與先前光合作用參數(shù)的變化一致，類囊體膜、光合膜、類囊體和葉綠體相關(guān)蛋白也下調(diào)，表明小麥葉片的光合作用受到嚴(yán)重破壞（圖4A）。

KEGG結(jié)果顯示，DEPs 富集于五大類通路（新陳代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程和生物體系統(tǒng)），包括25條重要通路，其中，碳代謝最為突出，其次是光合生物的碳固定、代謝途徑氨基酸的生物合成、光合作用和 TCA 循環(huán)（圖B-C）。在前人擬南芥的相關(guān)研究中也有類似的結(jié)果，九條差異最大的通路被分為兩個(gè)簇，紅色模塊以氨基酸的生物合成為中心，與碳代謝、光合生物的碳固定、代謝途徑、氨基酸的生物合成、TCA 循環(huán)、核糖體以及果糖和甘露糖代謝有關(guān)，被顯著上調(diào)，藍(lán)色模塊是光合作用，被顯著下調(diào)（圖4D）。PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果如圖5所示，該網(wǎng)絡(luò)涉及光合生物的核糖體、光合作用、氧化磷酸化、蛋白酶體、蛋白質(zhì)折疊、TCA 循環(huán)、嘧啶代謝和碳固定。

圖4 蛋白組分析

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

作者接下來進(jìn)行了代謝組分析，共鑒定出119種代謝物，主要包括碳水化合物、脂肪酸、有機(jī)酸、醇類、氨基酸和其他化合物。多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，抗生素處理后小麥幼苗的代謝物有顯著變化（圖 6A-B），其中對(duì)分類貢獻(xiàn)最顯著的分別為天冬酰胺、麥芽糖、乳糖、糖類、絲氨酸和丙氨酸（圖6C-D），KEGG分析中富集了20條通路（圖6E），包括TCA 循環(huán)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等，綜合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的分析結(jié)果，TCA 循環(huán)是顯著上調(diào)的常見途徑（圖 6F），而在蛋白質(zhì)組學(xué)中，對(duì)下調(diào)途徑光合作用的影響也很明顯（圖 6G），在 TCA 循環(huán)途徑中，許多酶活性均上調(diào)（圖 6F）。在光合系統(tǒng)中，PSI、PSII、細(xì)胞色素 b6/f 復(fù)合物、F 型 ATPase 和光合電子傳遞相關(guān)蛋白顯著下調(diào)，從而破壞了植物的光合作用（圖 6G）。

圖6 不同代謝物的變化

在這篇研究中，作者通過研究發(fā)現(xiàn)氟苯尼考脅迫對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)、氧化防御酶、光合系統(tǒng)活性和超微結(jié)構(gòu)均有負(fù)面影響。蛋白質(zhì)組分析表明，氟苯尼考破壞了小麥幼苗的光合途徑，改善了蛋白質(zhì)合成和能量代謝以應(yīng)對(duì)脅迫。代謝組分析表明，氟苯尼考脅迫會(huì)刺激多種代謝途徑。綜上所述，作者闡明了小麥幼苗對(duì)氟苯尼考脅迫的響應(yīng)，其中，TCA循環(huán)是顯著上調(diào)的常見途徑，而光合作用途徑則顯著下調(diào)。