玉米籽粒

RNA測序，蛋白質組，金屬離子檢測，可溶性糖檢測，淀粉含量測定，總蛋白含量測定，RNA原位雜交，免疫印跡檢測，雙熒光素酶報告反應，DAP-seq，pull-down，Co-ip，BiFC，LCI，qRT-PCR，ChIP-qPCR，EMSA等。

1、 ZmNAC128和ZmNAC130對胚乳充實至關重要

先前的研究中表明，ZmNAC128和ZmNAC130被RNAi干擾后，植株的千粒重降低了30%。因此，作者根據CRISPR Cas9技術獲得了不同的突變體，單突變體與野生型的籽粒表型相似，雙突變體均表現除不飽滿籽粒的表型，作者選取了單突變體zmnac128、zmnac130和雙突變體zmnac128 zmnac130進行了后續的研究。

對籽?？v切觀察后發現，zmnac128 zmnac130的胚乳內有一個空洞，外圍胚乳變得絮狀，而單突變體zmnac128和zmnac130的果仁表型與WT相同，且掃描電子顯微鏡（SEM）觀察表明，zmnac128 zmnac130胚乳中的淀粉顆粒（SG）比WT小（圖1A）。從百粒重（HKW）上來看，zmnac128 zmnac130的比WT低56.8%，而單突變體沒有顯著降低（圖1B）。近紅外光譜的分析結果表明，單突變體中的淀粉和蛋白質含量略有降低，而雙突變體的中蛋白質和淀粉的含量降低了50%以上

上述結果表明，ZmNAC128和ZmNAC130在促進胚乳充實方面具有冗余作用，同時失去時會嚴重影響貯藏儲備的積累。

圖1 ZmNAC128和ZmNAC130突變導致籽粒填充不良

2、 RNA-seq結合DAP-seq進行ZmNAC128和ZmNAC130的功能解析

為了研究基因調控網絡，作者取胚乳進行了RNA-seq分析，單突變株分別僅有80和2個差異基因（DEG），而雙突變株中存在2686個DEGs（圖2A）。在DEGs的富集結果中觀察到兩個GO條目，其中GO0045735是營養庫活性，主要包括玉米蛋白家族基因，此外，多種碳水化合物代謝相關通路也被富集（圖2B）。上述結果表明，ZmNAC128和ZmNAC130在玉米蛋白和淀粉的生物合成中起著關鍵作用。

DAP-seq測定結果表明，兩種NAC結合的所有峰中約有60%位于距轉錄起始位點（TSS）約3kb的基因區，其中40%以上位于TSS的1kb范圍內（圖2C）。進一步分析表明，峰值主要集中在緊靠TSS的上游（圖2D），這與ZmNAC128和ZmNAC130作為TFs的功能相一致。通過IGV進行可視化分析后，在16-kD γ-zein和Bt2的啟動子中，鑒定出的順式元件ACGCAA被ZmNAC128和ZmNAC130的結合峰所包圍（圖2E），利用MEME-ChIP工具探索后發現ZmNAC128和ZmNAC130結合的最重要順式元件也是ACGCAA。

圖2 RNA-seq聯合DAP-seq研究ZmNAC128和ZmNAC130的直接靶點

此外，作者在另外兩個γ-zein（27-kD和50-kD）的啟動子中觀察到了與ZmNAC128和ZmNAC130結合相應的峰值，啟動子起始密碼子上游結合峰區周圍檢測到了保守基序ACGCAA（圖3A）。為了檢測ZmNAC128和ZmNAC130與兩個啟動子中含有ACGCAA的片段的結合情況，作者隨后進行了ChIP-qPCR檢測，如圖3B所示，結果證明結合關系的確存在。后續的雙熒光素酶報告實驗的驗證中，ZmNAC128或ZmNAC130顯著提高了兩個啟動子的活性（圖3C）。

上述結果表明，ZmNAC128和ZmNAC130在淀粉和蛋白的累積中起重要作用。

圖3 27-kD γ-zein和50-kD γ-zein是ZmNAC128和ZmNAC130的直接靶點

3、 ZmNAC128和ZmNAC130直接調控多個重要淀粉代謝基因的表達

為了檢測ZmNAC128和ZmNAC130對淀粉代謝的影響，作者對主要淀粉代謝酶蛋白進行了一系列免疫印跡檢測（圖4A）。結果表明，與WT相比，zmnac128 zmnac130中相應的蛋白質積累也減少了近80%，四種淀粉生物合成酶（包括GBSS1、SS1、SSIIa和ISA1）的積累也減少了50%以上。這些結果表明，幾乎所有檢測到的蛋白質在雙突變株中都有所降低，淀粉含量和粒重顯著降低的主要原因之一。進一步的分子分析表明，除Bt2外，另外五個基因（Zpu1、GBSS1、SS1、SSIIa和Sus1）的啟動子也含有保守順式元件ACGCAA（圖4B），ChIP-qPCR和雙熒光素酶實驗進一步驗證了ZmNAC128和ZmNAC130與這五個基因啟動子的結合關系（圖4C-D）。

上述結果表明，ZmNAC128和ZmNAC130通過直接調控這些淀粉代謝基因，發揮了淀粉代謝核心TF的功能。

圖4 淀粉代謝基因作為ZmNAC128和ZmNAC130的直接靶點

4、  ZmNAC128和ZmNAC130直接調控O2的表達

Opaque2（O2）是與玉米蛋白生物合成相關的轉錄因子，在已知的胚乳填充相關TF基因中，O2、ZmNAC128和ZmNAC130在填充期胚乳中的表達量最高。RT-qPCR分析表明，在整個灌漿期，Zmnac128 Zmnac130胚乳中O2的轉錄水平平均下降了近50%，蛋白積累也顯著減少了60%-80%（圖5A-B），這證明ZmNAC128和ZmNAC130在整個灌漿期有維持胚乳中O2高表達的作用。

為了確認ZmNAC128和ZmNAC130是否直接調控O2的表達，作者檢查了DAP-seq數據，O2啟動子中出現了結合區域相對應的明顯峰值，隨后通過電泳遷移試驗（EMSA）確定具體候選基因，探針覆蓋了O2基因起始密碼子上游-510到-360bp的151bp區域，P3片段結合形成延遲帶，ChIP-qPCR也說明了這種結合關系（圖5D-E）。最后，進行了雙熒光素酶報告反應驗證了ZmNAC128或ZmNAC130顯著提高了O2啟動子驅動的LUC活性（圖5F）。

這些結果表明，這兩種NAC在直接激活O2的高表達方面發揮了關鍵作用。

圖5 ZmNAC128和ZmNAC130調控灌漿胚乳中O2的表達

5、 三種轉錄因子的物理相互作用

為了檢測三種TF之間的相互作用，作者進行了一系列體外和體內蛋白質-蛋白質相互作用檢測：pull-down，BiFC，LCI和Co-IP（圖6A-C）。結果表明，ZmNAC128與O2、ZmNAC130和自身相互作用，而ZmNAC130與ZmNAC128和自身相互作用。

圖6 體外和體內實驗顯示O2、ZmNAC128和ZmNAC130之間存在相互作用

6、  ZmNAC128、ZmNAC130和O2的聯合調控效應

為了研究這三種TF對胚乳填充的綜合影響，作者構建了一個zmnac128 zmnac130 o2三重突變體。與雙重突變體相比，三重突變后的籽粒表型更不飽滿，百粒重有所降低，淀粉含量和蛋白質含量均降低（圖7A-C）。

圖7 O2、ZmNAC128和ZmNAC130的三重突變導致更差的籽粒表型

進一步的RNA-seq分析表明，與o2相比，zmnac128 zmnac130 o2 的轉錄組與zmnac128 zmnac130的轉錄組更為相似，zmnac128 zmnac130 o2 的DEGs數量略高于zmnac128 zmnac130，但比o2高兩倍，DEGs的Venn圖展示出，超過60%的DEGs在zmnac128 zmnac130 o2和zmnac128 zmnac130之間共享（圖8A-C），這表明Zmnac128和Zmnac130對胚乳填充的影響強于O2。在針對三種突變體共有的DEGs進行分析時，營養庫活性是最顯著的GO條目，與對玉米素家族基因表達的強烈影響是一致的。庫馬西亮藍染色顯示，除了27-kDγ-zein外，大多數玉米蛋白幾乎不可見（圖8D）。此外，大多數淀粉代謝基因和其他碳水化合物代謝基因在zmnac128 zmnac130 o2、zmnac128 zmnac130和o2中被下調至相似程度，免疫印跡分析的結果表明，相關基因的蛋白水平表達量也有所降低（圖8E）。

圖8 O2、ZmNAC128和ZmNAC130協同影響玉米蛋白和淀粉代謝酶的表達

7、  ZmNAC128、ZmNAC130和O2調控BETL中關鍵轉運基因的表達

RNA原位雜交結果顯示，ZmNAC128和ZmNAC130不僅在淀粉胚乳（SE）中表達，而且在胚乳基底轉移層（BETL）中表達(圖9A)。轉錄數據表明，與WT相比，ZmSWEET4c、ZmSUGCARI、ZmYSL2和ZmMNI的表達在zmnac128 zmnac130中均顯著下調（圖9B），DAP-seq中，ZmSWEET4c和ZmSUGCAR的啟動子中存在與ZmNAC128和ZmNAC130結合區域對應的峰，ChIP-qPCR顯示出了一樣的結果。雙熒光素酶實驗表明，僅ZmSWEET4c、ZmSUGCAR1和ZmYSL2的活性被激活，且與單突變相比，雙突變并無顯著差別（圖9C-E）。

圖9 ZmNAC128和ZmNAC130調控ZmSWEET4c、ZmSUGCAR1和ZmYSL2的表達

8、  ZmNAC128、ZmNAC130和O2對糖和營養吸收的影響

為了確認3個核心TFs的突變是否影響籽粒營養物質的吸收，作者成熟干粒中的可溶性糖和運輸元素的含量，結果表明，與對照組相比，o2的葡萄糖、果糖和蔗糖水平顯著增加，zmnac128 zmnac130中的蔗糖水平明顯下降，而zmnac128 zmnac130 o2中這三種可溶性糖的水平要比zmnac128 zmnac130和o2高很多。上述數據反映了三個核心TF在淀粉合成中的重要性，ZmNAC128和ZmNAC130的功能缺失突變確實影響了籽粒對糖分的吸收，尤其是對蔗糖的吸收。

在元素水平上，與o2相比，zmnac128 zmnac130的鉀含量顯著降低，但與對照組相比無顯著差異；而在鋅水平上，zmnac128 zmnac130比o2和對照均顯著降低；鐵水平無顯著變化。

綜上，O2、ZmNAC128和ZmNAC130可能部分通過調節ZmSWEET4c、ZmSUGCAR1和ZmYSL2的表達來影響可溶性糖、鋅和鉀的吸收。

圖 10 O2、ZmNAC128和ZmNAC130的突變影響籽粒中可溶性糖和元素的水平

【小結】

在這項研究中，作者利用RNA-seq，蛋白組檢測，雙熒光素酶報告反應，免疫印跡檢測等手段，發現了在玉米籽粒的發育過程中，ZmNAC128和ZmNAC130與O2相互配合，從BETL的營養吸收到SE的淀粉及玉米蛋白合成，促進胚乳充實，同時調節自身的表達。該發現極大地拓寬了對谷粒充實的認識，對提高谷物的充實效率具有潛在的重要意義。

【精品解讀】