根據電荷性質和分子大小的差異，通過離子交換和凝膠過濾層析等方法從枸杞中分離得到LFP-W1、LFP-2、LFP-3和LFP-4。

通過掃描電鏡發現四種多糖的表面形態各異，有結構松散的如LFP-W1，有表面光滑的如LFP-3.不同的表面形態也指代了多糖具有不同的分支結構。

從AFM觀察到LFP的形態也各異。這些發現表明，LFP結構的變化引起了表面形貌和外觀的改變，這可能源于分子間力和空間機械穩定性的差異。

圖1 LFPs的表面形貌

在HPGPC上LFPs多糖為一致對稱的單峰，表明了其的均一性。經標曲計算，LFP-4的最大分子量為325.12 kDa，剩余多糖LFP-W1、LFP-2和LFP-3分別為45.85、46.84和85.80 kDa。據推測，LFP-4分子量大，醛酸含量高，可能與其作為植物細胞壁的主要成分有關。

四種多糖的紅外光譜均表現出屬于糖類基質的典型吸收峰。其中LFP-2、LFP-3和LFP-4在1738 cm^-1附近的強吸收峰，以及1235.0-1258.0 cm^-1范圍內的弱帶，是由于酯或羧基中的C=O的拉伸振動，表明存在醛酸。

圖2 .LFPs的均勻性和組成。(A) HPGPC光譜;(B) FT-IR光譜

單糖結果表明，LFP-W1中性多糖含量最高，LFP-2、3、4的糖醛酸含量依次升高。LFP-W1的單糖組成以阿拉伯糖(Ara)和半乳糖(Gal)為主，并伴有少量鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)和葡萄糖(Glc)。

LFP-2、LFP-3、LFP-4為酸性雜多糖，半乳糖醛酸(GalA)含量依次遞增。高占比的GalA表明HG結構域的存在。同樣，Rha也存在于所有三個酸性餾分中，表明它們可能具有RG-I的結合聚糖結構。并且隨著GalA含量的增加，Gal含量逐漸降低。此外，還存在大量阿拉伯糖，表明存在阿拉伯糖或AG。

表1. LFPs的理化及組成

圖3.LFPs的理化性質。(A)單糖組成分析。混合標準單糖和LFPs峰:1-8分別為Rha/Ara/Xyl/ Man/Glc/Gal/GlcA/GalA。(B)羧基還原LFPs的PMAAs總離子色譜圖

表2. LFPs的糖苷鍵組成

大多數糖苷殘基的糖苷鍵類型相同，但質量比不同，這與單糖組成的結果一致，是造成糖苷殘基結構差異的主要原因?！?)-GalpA(1→是LFP-3以及LFP-4的主要殘基結構，和大多數的果膠多糖一致。總體甲基化結果與單糖分析基本一致。一些酸性多糖與單糖組成存在差異，這可能是由于羧基還原不足，甲基化不完全或水解過程中去甲基化引起的一些副反應所導致。

利用一維及二維核磁圖譜分析了LFPs的結構特征。以LFP-2為例，LFP-3和LFP - 4的共同信號峰以相同的方式表征。LFP-2的異構體信號分布在δ 4.32-5.14)和δ 98.40-109.59區域，是多糖核磁共振信號的典型分布。通過一維結合二維的圖譜解析，最終得到LFP-2的結構模型。

圖4. LFP-2的核磁共振譜

圖5. LFP-2可能重復單元的結構示意圖

通過測量LFPs的DPPH、ABTS⁺和-OH清除活性來評估其抗氧化性能。在不同的實驗組中觀察到對LFPs治療的劑量依賴性反應。與LFP-W1、LFP-2和LFP-4相比，LFP-3對DPPH、ABTS⁺和-OH的清除能力最強。

與酸性LFP-2、LFP-3和LFP-4相比，中性LFP-W1的抗氧化能力較弱，但在-OH清除能力方面優于LFP-2。酸性LFPs抗氧化活性的增強可能與糖醛酸引入陰離子基團有關。

圖6. LFPs的生物活性熱圖

以H₂O₂氧化損傷的ARPE-19細胞作為氧化應激模型，評價LFPs的抗氧化能力。

與對照組相比，H₂O₂明顯降低了細胞存活率。在12.5-200 μg/mL的濃度范圍內，LFPs以劑量依賴性的方式逐漸挽救了下降的存活率。事實上，GSH和SOD活性的增加以及MDA活性的降低有助于清除多余的細胞自由基，從而維持氧化穩態。從圖6可以看出，所有LFPs都具有抗氧化能力效果略有不同，在這種情況下，可以作為天然抗氧化活性成分的潛在來源。

胰島素通路是影響秀麗隱桿線蟲壽命的經典通路之一，daf-2、daf-16和age-1是主要的調控信號基因。如圖6所示，與對照組相比，LFPSs干預后daf-2和age-1 mRNA基因表達明顯下調，daf-16基因表達明顯上調。

過量的ROS積累引起機體細胞內生物大分子氧化應激，導致細胞蛋白和DNA損傷，從而縮短整體壽命。連續飼喂LFPs可逐漸增強對ROS產生的清除，但不同LFPs對pq觸發的氧化應激的抵抗能力不同。如圖7所示，與模型組相比，中性LFPS-W1處理下線蟲體內ROS積累量的下降且呈現明顯的梯度效應。與其他酸性多糖相比，LFPS-4顯著降低了線蟲的相對熒光強度。這些結果表明，LFPs減少了細胞內氧化損傷，延長了蠕蟲的壽命。

圖7.具有代表性的熒光顯微照片和相對熒光強度在ROS生產中的定量

圖8.與LFPs生物活性相關的部分結構熱圖分析

多糖復雜的化學結構提供了大量攜帶豐富生物信息的活性基團，是產生多重生物效應的物質基礎。但這也為多糖的構效關系和機理的研究設置了很大的障礙。為了評估LFPs的構效關系，使用熱圖Pearson相關性進行分析。

如圖8所示，Mw與SOD 、GSH 和MDA呈負相關。過高的分子量不利于將高度特異性的碳水化合物結構與受體或蛋白質結合。LP多糖在降低其分子量后，其構象由致密的球形結構變為隨機的線圈結構，顯著促進了其與血小板的相互作用。

GalA和總醛酸含量與DPPH和ATBS⁺活性呈正相關。GalA含量多寡與其抗氧化活性與羧基的存在和空間定位密切相關。但含量不是越高越好，GalA含量過高會降低多糖的溶解度，增加其黏度，從而阻礙多糖分子發揮其生物活性。相反，Gal、Ara和Glc等中性單糖含量與DPPH和ATBS+呈顯著負相關?？偟膩碚f，具有較強抗氧化活性的多糖通常在特定的范圍內具有相對的GalA和Mw。

分支度和中性糖苷鍵被認為是抗衰老效果較強的積極特征，羥基的數量和側鏈的氫傳遞能力起關鍵作用。先前的報道也證明了中性多糖在衰老小鼠和秀麗隱桿線蟲模型中的抗衰老作用，其中中性糖苷鍵發揮了不可磨滅的作用。

綜上所述，多糖結構的不同導致了生物活性的不同取向。影響這一結果的主要因素是酸性多糖和中性多糖的結構差異。然而，構效關系并不是簡單的一對一對應關系。潛在的相互作用需要更詳細的化學特征和進一步的研究來確定它們的結合性質，這可能是更深入、更全面地了解具有生物活性的活性中心或活性片段的關鍵。

綜上所述，作者從枸杞子中得到了四種均相多糖。理化信息表明，LFP-W1為高支鏈中性阿拉伯半乳聚糖，LFP-2、LFP-3和LFP-4為由阿拉伯半乳聚糖、鼠李糖和半乳糖醛酸組成的酸性果膠多糖。

作為一種良好的天然抗氧化劑，它們在體外和體內均表現出良好的抗氧化和延緩衰老的能力。不同結構特征的多糖活性差異較大，中性多支多糖具有較強的調節衰老基因的能力，而適當Mw和GalA含量的酸性多糖具有較強的體外抗氧化能力。然而，中性和酸性多糖有益作用的分子基礎有待揭示，需要對高等模式生物進行更多的工作，以更充分地了解取向差異。綜上所述，該項研究進一步促進了LFP作為下一代抗氧化和抗衰老干預的實用療法的發展。