背 景
非生物脅迫會影響作物蛋白質、脂質、非結構性碳水化合物、礦物質、抗氧化劑、飼料價值以及物理和感官特性。然而，非生物脅迫對營養和功能特性的影響因作物而異；例如，干旱脅迫會增加葡萄中的酚類濃度，但會降低馬鈴薯中的酚類濃度。鹽脅迫提高了西蘭花中的酚類濃度，但降低了生菜中的酚類濃度。我國鹽堿地面積超過5億畝，給我國糧食安全帶來重大隱患。然而，目前還沒有關于作物籽粒響應堿脅迫的研究。糜子是一種古老的谷類作物，廣泛種植在伴隨鹽堿脅迫的干旱半干旱地區，且糜子籽粒具有寶貴的食用價值，但目前關于堿脅迫對糜子籽粒代謝物豐度的綜合定性和定量信息仍是空白。
2023年6月，Food Research International（IF= 8.1）雜志上發表的一篇題為“Widely targeted metabolomic analysis revealed the effects of alkaline stress on nonvolatile and volatile metabolites in broomcorn millet grains”的研究論文，從糜子籽粒功能性物質和營養成分的角度描述了堿脅迫對糜子籽粒品質的影響，為堿化地區的糜子食品化學和功能性食品開發研究提供有價值的信息。在這項研究中，三黍生物提供了相應酚酸、類黃酮等代謝物及礦質元素檢測服務。
【樣本類型】
糜子籽粒
【技術方法】
靶向代謝檢測
LC-MS非靶代謝
GC-MS非靶代謝
【技術路線】
【研究結果】
·糜子籽粒對堿脅迫的生長和理化響應
在本研究中，作者比較了堿敏感糜子S223和耐堿糜子T289在正常和堿脅迫條件下的籽粒生長特性和理化性質。結果表明，堿脅迫顯著減少了兩個糜子品種的單株穗粒數、單株鮮/干粒重和千粒重。此外，堿脅迫顯著減少了糜子籽粒的長度，但對籽粒寬度沒有顯著影響（圖 1），籽粒中的總酚、總類黃酮、花青素、類胡蘿卜素和單寧含量，以及維生素E（VE）和維生素B（VB）含量均有所改變。S223中的δ-VE和VB2含量也大幅增加。與對照（CK）相比，籽粒中N、Mg、Mo、Na、Al、Sr、Ba的含量在堿脅迫（AS）組顯著增高，而Cu、Cr的含量顯著降低。Na增加幅度最大，堿脅迫下S223和T289的Na含量分別是正常條件下的17.05和6.20倍。堿脅迫對兩個品種K、Ca、Fe、Ti、Mn、Zn和Ni濃度的影響不一致。堿脅迫對籽粒P、B、Pb、Co和Li含量沒有顯著影響（圖 2）。
圖 1 堿脅迫對糜子籽粒發育的影響
圖2 堿脅迫對糜子籽粒活性成分及礦質營養的影響
·糜子籽粒對堿脅迫的非揮發性代謝組響應
隨后，我們對糜子樣品中的代謝物進行了代謝組學分析。兩個糜子品種在正常和堿脅迫條件下的籽粒代謝存在明顯差異（圖3A-E）。在S223CK與S223AS中鑒定出114個差異代謝物（DAM），在T289CK與T289AS中鑒定出89個DAM，其中包括28個共有DAM（圖3F）。
聚類分析結果顯示DAM可被分為6個亞類（圖4A），其中，S223組中，生物堿、酚酸、氨基酸及其衍生物、其他代謝物、核苷酸及其衍生物、黃酮類、有機酸、木質素、香豆素、萜類和脂類分別占21.9％、20.18％、14.04％、9.65％、7.02％、6.14％、6.14％、5.26％、5.26％和4.39％，T289中的物質分類也如圖所示（圖4 B）。
如圖5A所示，堿脅迫后，S223和T289的揮發性代謝物均有較大差異，分別鑒定到43個下調DAM和71個上調DAM以及10個下調和79個上調DAM（圖5B-C）。其中，S223中最顯著上調的代謝物是血清素，最顯著下調的是左旋肉堿，T289中，十六戊二酸是最顯著上調的代謝物，而2-羥基異戊酸是最顯著下調的代謝物（圖3D）。
圖 3 比較組間非揮發性代謝物分析
圖4 差異代謝物K-Means聚類分析和不同類型差異代謝物百分比
圖5差異非揮發性代謝物分析
·糜子籽粒不同種類非揮發性代謝物對堿脅迫的響應
在本研究中，鑒定到的非揮發性差異積累代謝物涉及生物堿、酚酸、類黃酮、氨基酸及其衍生物、有機酸等多類代謝物（圖6）。
其中，生物堿類代謝物的顯著差異可能歸因于堿脅迫處理對不同耐堿性糜子品種的影響；堿脅迫對兩個糜子品種籽粒中氨基酸及其衍生物的影響并不完全一致，S223籽粒中大部分氨基酸及其衍生物在堿脅迫下顯著增加；28個類黃酮差異代謝物表明，糜子籽粒可能通過類黃酮的積累抵抗堿脅迫；而兩品種籽粒本身的酚酸類代謝物含量存在明顯差異，這可能導致兩個品種在堿脅迫下籽粒中酚酸反應的不同變化；此外，還檢測到15個差異積累的有機酸代謝物，堿脅迫上調了S223籽粒中γ-氨基丁酸、粘康酸、4-苯基丁酸、1-甲基哌啶-2-羧酸、2-異丙基蘋果酸和3-羥基戊二酸的積累，同時下調了D-赤蘚酮的積累，在T289中，籽粒中檸檬酸、異檸檬酸、L-蘋果酸、DL-3-苯乳酸*、1-甲基哌啶-2-羧酸、3-甲基蘋果酸、2-丙基琥珀酸、草酸和3-羥基戊二酸積累，γ-氨基丁酸和2-羥基異己酸下調。
圖6 正常條件和堿脅迫下糜子籽粒中非揮發性代謝物的熱圖
·糜子籽粒對堿脅迫的揮發性代謝組響應
我們隨后檢測了糜子籽粒中揮發性代謝物的變化，在S223中鑒定出16個DAM， T289中檢測到20個DAM，其中存在3個共同的DAM（圖7 A-B）。堿脅迫后引起了兩品種糜子籽粒的揮發性代謝物積累發生變化（圖7 C-D）。
隨后，利用代謝物含量動態分布圖和雷達圖分析了S223和T289籽粒中Top10的差異代謝物（圖8A-B），結果表明，S223籽粒中下調最顯著的代謝物是雙環[3.1.1]庚-3-烯-2-酮，4,6,6-三甲基-，（1S）-。T289籽粒中上調最顯著的代謝物是苯乙烯。代謝物熱圖分析表明堿脅迫降低了S223籽粒中的大部分揮發性代謝物的相對含量，而增加了T289籽粒中大部分揮發性代謝物的相對含量（圖8 C）。
圖7 差異揮發性代謝物比較分析
圖8 差異揮發性代謝物的分析
·糜子籽粒品質特性相關途徑對堿脅迫的響應
上述綜合結果表明，在類黃酮生物合成途徑中，堿脅迫降低了S223和T289籽粒中野櫻素的積累。木犀草素在S223籽粒積累降低，但T289籽粒木犀草素的積累增加。同時，堿脅迫促進了芹菜素-7-O-新橙皮苷在黃酮和黃酮醇生物合成途徑中的積累。堿脅迫下，抗壞血酸和醛糖酸代謝途徑的所有代謝物積累增加。在本研究發現堿脅迫影響了糜子籽粒氨基酸和有機酸生物合成途徑。堿脅迫下，糜子籽粒中脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成和色氨酸代謝途徑被激活。同時，糜子籽粒通過調控氨基酸的生物合成和TCA循環響應堿脅迫。在堿脅迫下，糜子籽粒中L-蘋果酸、檸檬酸、異檸檬酸、L-瓜氨酸和L-甲硫氨酸積累增加。這些結果表明，糜子籽粒通過促進某些酚酸、類黃酮和抗壞血酸的合成，增加糜子籽粒抗氧化物質抵抗堿脅迫（圖 9）。同時，堿脅迫下，糜子籽粒中氨基酸和有機酸的積累增加，這可能影響糜子籽粒的風味品質。
圖 9 堿脅迫對糜子籽粒代謝相關途徑的影響
【小結】
在這項研究中，我們探究了堿脅迫下糜子籽粒功能性物質、營養物質的變化，揭示了通過調節苯丙素生物合成、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、抗壞血酸代謝、氨基酸和有機酸代謝途徑響應堿脅迫。本研究首次闡明了糜子籽粒非揮發性和揮發性代謝物對堿脅迫的響應，為堿化地區糜子種植和糜子衍生食品的開發提供了有價值的信息。
往期推薦
文字：牛晶晶
排版：野凌
審核：三黍生物市場部
