【背景】

丹參（Salvia miltiorrhiza，S. miltiorrhiza）是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值的模式藥用植物，丹參的根會(huì)合成一組稱為丹參酮（tanshinone）的二萜類親脂性生物活性成分。丹參酮的生物合成和調(diào)控引起廣泛關(guān)注。DNA甲基化變化在調(diào)控植物種子發(fā)育、莖和葉生長(zhǎng)、春化、果實(shí)成熟和次級(jí)代謝等方面發(fā)揮著重要作用。然而丹參的甲基化組尚未得到分析，DNA甲基化在丹參酮合成過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制仍然未知。

【樣本類型】

S.miltiorrhiza 系 99-3丹參

【技術(shù)方法】

WGBS，RNA-seq，qRT-PCR，sRNA測(cè)序

【摘要】

本研究應(yīng)用無(wú)偏好性的全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）分析了丹參根和葉的單堿基分辨率DNA甲基化組。比較分析揭示了CG、CHG和CHH序列的差異甲基化模式，以及DNA甲基化與基因和小RNA（sRNA）表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。分析結(jié)果表明，低甲基化基因的表達(dá)水平較高，24nt sRNA（24-nucleotide sRNA）可能關(guān)鍵性參與丹參RdDM（RNA-directed DNA methylation）通路。DNA甲基化變異分析表明，CHH甲基化是造成差異的主要原因。GO富集分析表明，與March_root相比，hypoCHHDMR下游重疊基因在July_root的二萜生物合成過(guò)程顯著富集。丹參酮生物合成相關(guān)酶基因如DXS2、CMK、IDI1、HMGR2、DXR、MDS、CYP76AH1、2OGD25和CYP71D373，在July_root基因啟動(dòng)子或下游區(qū)域中的CHH甲基化水平低于March_root。與March_root相比，July_root基因表達(dá)上調(diào)，DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷的處理顯著促進(jìn)了丹參酮合成。研究結(jié)果揭示了DNA甲基化通過(guò)改變丹參酮關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子或下游CHH甲基化水平，在丹參酮生物合成中起重要調(diào)控作用。

【研究結(jié)果】

為了揭示丹參DNA甲基化的特征及其調(diào)控作用，我們首先通過(guò)BLAST搜索擬南芥DNA甲基化途徑相關(guān)基因，針對(duì)丹參99-3系全基因組進(jìn)行分析。結(jié)果鑒定出39個(gè)基因，其中12個(gè)是先前報(bào)道的，而其他26個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的(表1)。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析表明，除了MORC6外，所有DNA甲基化途徑相關(guān)基因都在丹參中表達(dá)(表1)。

為了便于甲基化分析，我們將丹參99 - 3系基因組通過(guò)連接21045個(gè)小支架構(gòu)建成6個(gè)超級(jí)支架。圖1a顯示了superscaffold1至superscaffol5 DNA甲基化的全局格局，如圖1a所示，在三種序列背景下，轉(zhuǎn)座因子(TE)覆蓋率與DNA甲基化水平呈正相關(guān)。相反，基因密度呈負(fù)相關(guān)(圖1a)。詳細(xì)分析TE區(qū)和基因區(qū)DNA甲基化水平發(fā)現(xiàn)，TE區(qū)甲基化水平明顯高于基因區(qū)(圖1b)，證實(shí)了圖1a的觀察結(jié)果。基因區(qū)的mCG表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄起始/結(jié)束位點(diǎn)減少，而基因體和側(cè)翼區(qū)域增加。mCHH和mCHG在側(cè)翼區(qū)域升高，但在基因體中相對(duì)減少(圖1b)。TE體內(nèi)所有序列上下文的甲基化水平都高于上游或下游區(qū)域(圖1b)。對(duì)丹參基因組中mC的進(jìn)一步分析表明，四個(gè)CG亞背景具有相似的甲基化水平(圖1d)，盡管它們表現(xiàn)出不同的密度(圖1c)。在CHG子環(huán)境中，CCG的密度和甲基化水平低于CAG和CTG(圖1c和d)。在CHH子環(huán)境中，CAA的密度和甲基化水平最高，CCH (CCC、CCA和CCT)的甲基化水平低于CAH (H = A、T或C)和CTH(圖1c和d)。

圖1 丹參DNA甲基化圖譜

為了了解基因表達(dá)與DNA甲基化之間的關(guān)系，我們根據(jù)表達(dá)水平將基因分為五組。結(jié)果顯示基因表達(dá)與DNA甲基化呈負(fù)相關(guān)，但基因體mCG與轉(zhuǎn)錄之間沒(méi)有負(fù)相關(guān)(圖2a)。這提示了DNA甲基化在基因表達(dá)中的調(diào)控作用，并暗示了DNA甲基化與基因表達(dá)之間的復(fù)雜性。最重的基因體mCG出現(xiàn)在中等高表達(dá)基因(10 < FPKM≤50)中(圖2a)。這與以往對(duì)其他植物的研究結(jié)果一致。此外，在啟動(dòng)子和下游區(qū)域，高表達(dá)基因mCG水平較低，而在基因體區(qū)域，高表達(dá)基因(FPKM >50)和低表達(dá)基因(0 < FPKM≤1)mCG水平最低，mCG水平相對(duì)較低(圖2b)。提示mCG參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在側(cè)翼區(qū)和基因體區(qū)存在差異。對(duì)于mCHG和mCHH，高表達(dá)基因的所有三個(gè)基因區(qū)域(基因啟動(dòng)子、下游和體)的甲基化水平均較低(圖2b)。為了進(jìn)一步分析DNA甲基化的作用，將基因分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。比較了不同基因組區(qū)域的甲基化水平。結(jié)果表明，無(wú)論基因組區(qū)域如何，低表達(dá)基因在所有序列背景下都具有更高程度的DNA甲基化水平(圖2c)。這些數(shù)據(jù)表明，在丹參中，DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生功能限制。

圖2 DNA甲基化在基因表達(dá)中的作用

為了研究丹參sRNAs在DNA甲基化中的作用，我們利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)March_root和July_root的sRNAome進(jìn)行了測(cè)序。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制和適配器修剪，在March_root和July_root中分別獲得12 126 660和11 303 818條干凈reads。21-、22-和24-核苷酸的sRNAs在兩種組織中最豐富(圖3a)。mC和* mC的數(shù)量分別與24核苷酸sRNAs的胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤數(shù)量密切相關(guān)(圖3b)。最后，我們分析了整個(gè)基因組中2000-bp箱子內(nèi)24-核苷酸sRNAs與環(huán)境特異性甲基化水平之間的相關(guān)性。CHH DNA甲基化與24-nt sRNA之間的相關(guān)性最高(圖3c)。分布模式分析顯示，丹參24核苷酸sRNAs優(yōu)先位于啟動(dòng)子和基因的3≥f邊緣區(qū)域(圖3d)。它們?cè)赥E的5≥和3≥f邊緣區(qū)域的分布與基因的啟動(dòng)子和3≥f邊緣區(qū)域相當(dāng)，而在TE小體區(qū)域，24核苷酸sRNAs的分布要高得多(圖3d)。有趣的是，基因區(qū)域的24-nt sRNA在July_root中豐度高于March_root，而TE區(qū)域無(wú)明顯差異(圖3d)。綜上所述，24個(gè)核苷酸的sRNAs可能是丹參RdDM通路的關(guān)鍵參與者。

圖3 DNA甲基化與24nt sRNA的相關(guān)性

我們計(jì)算了3個(gè)樣本(包括March_root、July_root和July_leaf)中基因和TE區(qū)域的平均DNA甲基化水平。在兩個(gè)根樣品中，對(duì)稱序列上下文(CG或CHG)在基因和TE區(qū)域的甲基化水平相當(dāng)，而mCHH水平在七月根中低于三月根(圖4a和b)。這表明mCHH在丹參根中的重要性。與July_root相比，July_leaf基因和TE區(qū)域的甲基化水平較低，對(duì)于mCHH序列上下文尤其如此(圖4a和b)。當(dāng)計(jì)算全局甲基化水平時(shí)，也觀察到類似的趨勢(shì)(圖4c)。考慮到基因表達(dá)與DNA甲基化之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖2)，這些結(jié)果表明，紫檀葉中的基因表達(dá)通常比丹參根中的基因表達(dá)更活躍。

由于DNA甲基化差異可能是由現(xiàn)有mC的甲基化水平差異或總mC的數(shù)量差異造成的，因此我們比較分析了三種丹參樣品的DNA甲基化水平和mC的數(shù)量。結(jié)果顯示，與March_root相比，July_root的甲基化水平和mCHH的數(shù)量有所降低，而mCG和mCHG的甲基化水平和mCHH的數(shù)量相似(圖4d和e)。這表明，mCHH的甲基化水平和mCHH的數(shù)量都是導(dǎo)致March_root和July_root DNA甲基化差異的原因。此外，在所有三個(gè)序列背景下，July_root中mCs的甲基化水平都高于July_leaf(圖4d)，而July_root中mCs的數(shù)量略低(圖4e)。由此可見(jiàn)，紫檀根與紫檀葉DNA甲基化的差異主要與mC甲基化水平有關(guān)，而與mC數(shù)量無(wú)關(guān)。

圖4 丹參全基因組DNA甲基化比較分析

為了初步闡明高dmr和低dmr相關(guān)基因在啟動(dòng)子、基因體和基因下游的潛在功能，我們進(jìn)行了GO富集分析。結(jié)果表明，與March_root相比，July_root的低dmr相關(guān)基因顯著富集了萜類生物合成和代謝相關(guān)基因(圖5)，而高dmr相關(guān)基因則顯著富集了更基本的代謝相關(guān)生物過(guò)程，如細(xì)胞氨基酸代謝過(guò)程和線粒體mRNA加工。這一結(jié)果與快速生長(zhǎng)的丹參根系中萜烯的生物合成和代謝比March_root更活躍的事實(shí)相一致，而July_root中丹參酮的含量高于March_root進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。由于July_root與July_leaf相比存在明顯的DNA高甲基化，我們對(duì)不同基因區(qū)域的三個(gè)序列背景的hyperdmr相關(guān)基因進(jìn)行了GO分析。參與葉片發(fā)育、葉綠素生物合成和代謝過(guò)程的基因在CG基因下游高度富集。對(duì)于其他不同基因組位置的上下文特異性dmr相關(guān)基因，執(zhí)行細(xì)胞氨基酸生物合成過(guò)程、DNA修復(fù)、mRNA加工和碳水化合物生物合成過(guò)程的基因顯著富集。這表明DNA甲基化可能是影響丹參葉片發(fā)育和生物學(xué)功能的重要調(diào)控因子。

圖5 與March_root相比，July_root的 hypoDMR相關(guān)基因在生物學(xué)過(guò)程顯著富集

對(duì)于高dmr相關(guān)基因，HMGR1具有啟動(dòng)子相關(guān)的CHHDMR;DXR和CPS1均含有與基因體及其下游重疊的CHHDMR;CYP76AH3包括一個(gè)顯示所有序列上下文差異甲基化的DMR和一個(gè)顯示對(duì)稱序列上下文差異甲基化的DMR，分別與基因啟動(dòng)子和小體以及小體和下游重疊(圖6b和7b)。對(duì)于次dmr相關(guān)基因，CMK在基因體中含有一個(gè)CHGDMR;DXS2、CYP76AH1和CYP76AK1分別與下游基因存在CGDMR重疊;其余基因均與chhdmr相關(guān)。在chhdmr相關(guān)基因中，DXS2、CMK和IDI1有chhdmr相關(guān)啟動(dòng)子。其他基因，包括HMGR2、DXR、MDS、CYP76AH1、2OGD25和CYP71D373，與下游基因有CHHDMR重疊(圖6b和7b)。

 圖6 丹參酮生物合成上游通路中的DMR相關(guān)酶基因

 圖7 丹參酮生物合成下游通路中的DMR相關(guān)酶基因

為了檢測(cè)DNA去甲基化在丹參酮生物合成中的意義，將DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷應(yīng)用于丹參酮毛狀根中。結(jié)果表明，經(jīng)5-氮胞苷處理的毛狀根比未處理的毛狀根顏色更紅(圖8a)。利用超高效液相色譜法(UPLC)進(jìn)一步測(cè)定隱丹參酮、丹參酮I、二氫丹參酮和丹參酮IIA，發(fā)現(xiàn)5-氮胞苷處理后，4種丹參酮的含量顯著增加，特別是30 μM 5-氮胞苷處理的毛狀根(圖8b)。對(duì)照和30 μM 5-氮雜胞苷處理的丹參毛狀根進(jìn)行了全基因組亞硫酸鹽測(cè)序。分析丹參酮生物合成途徑基因的DNA甲基化和表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在5-氮雜胞苷處理下，幾乎所有基因的DNA甲基化水平均下調(diào)，表達(dá)水平均上調(diào)。進(jìn)一步的DMR分析表明，經(jīng)5-氮胞苷處理的30 μM S中，所有鑒定的DMR相關(guān)基因均含有次dmrs。除CYP76AK1外的丹參毛狀根。綜上所述，DNA甲基化抑制劑處理可通過(guò)丹參酮生物合成途徑基因的去甲基化促進(jìn)丹參酮在丹參酮毛狀根中的生成。

【小結(jié)】

本研究首次在丹參中繪制了單堿基分辨率的全基因組DNA甲基化圖譜。結(jié)果表明， DNA低甲基化可以上調(diào)丹參的基因表達(dá)，24nt sRNA可能是RdDM通路的主要參與者。此外，DMC/DMR分析表明，差異甲基化主要發(fā)生在CHH序列中，與March_root相比，July_root中與hypoCHHDMR相關(guān)的基因在萜烯生物合成過(guò)程中富集。最重要的是，在July_root和March_root之間的14個(gè)DMR相關(guān)丹參酮生物合成酶基因中，包括DXS2、CMK、IDI1、HMGR2、DXR、MDS、CYP76AH1、2OGD25和CYP71D373在內(nèi)的9個(gè)基因在July_root基因啟動(dòng)子區(qū)或下游區(qū)域表現(xiàn)出CHH低甲基化。進(jìn)一步的DNA甲基化抑制劑處理促進(jìn)了丹參毛狀根中丹參酮的生物合成。總之，DNA甲基化可以通過(guò)丹參酮生物合成酶基因啟動(dòng)子和下游的CHH去甲基化來(lái)促進(jìn)丹參酮的生物合成。本研究為丹參酮生物合成的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制提供了新的見(jiàn)解，將有助于進(jìn)一步提高丹參活性化合物的產(chǎn)量。