作者首先培養(yǎng)了三種樂伐替尼耐藥HCC細胞系（Huh7-LR、PLC/PRF/5-LR和Hep3B-LR），結果表明，耐受細胞株的樂伐替尼敏感性較低，且與它親代細胞相比，細胞形態(tài)上表現(xiàn)出拉長的紡錘形（圖1A-C）。通過蛋白質組學檢測后發(fā)現(xiàn)，相比于非耐藥親代細胞，兩個關鍵的tRNA m7G甲基轉移酶復合物成分（METTL1和WDR4）在耐藥HCC細胞中顯著上調，WB結果也證實了該結果，相對應的，耐藥細胞中的tRNA m7G修飾水平也升高（圖1D-E）。

隨后，通過HCC患者的器官模型評估，作者發(fā)現(xiàn)大多數器官對樂伐替尼治療表現(xiàn)出耐藥性，而只有少數器官對侖伐替尼表現(xiàn)出敏感性（圖1F-G），且對樂伐替尼耐藥的HCC器官具有較高的METTL1和WDR4的表達水平（圖1H），HCC患者隊列的檢測表面，耐藥性患者體內METTL1和WDR4的表達也上調了（圖1I）。與METTL1或WDR4表達水平高的患者相比，表達水平低的患者預后更好（圖1J-M）。

上述結果證實了METTL1和WDR4可能在樂伐替尼耐藥方面發(fā)揮重要作用。

圖1 METTL1和m7G tRNA修飾在樂伐替尼耐藥細胞中上調

為了進一步證實METTL1作用，作者構建了METTL1敲低Huh7-LR、PLC/PRF/5-LR、Hep3B-LR細胞株，敲低細胞對樂伐替尼的敏感性有所回復，導致增殖能力受損（圖2B-C），存活克隆減少（圖2D-E），凋亡比例增加（圖2F-I）。為了研究METTL1是否通過tRNA m7G修飾來調節(jié)侖伐替尼的耐藥性，作者在對樂伐替尼先天敏感的親本Huh7細胞中過量表達了野生型METTL1和其催化無活性突變體，Northwestern blot結果表明，相比無活性突變體，野生型METTL1的過表達增加了tRNAs中的m7G修飾水平（圖2J）、Huh7細胞對樂伐替尼的耐藥性、殖能力（圖2K）及存活的克隆數（圖2L），同時減少了凋亡比例（圖2M-N）。

上述結果表明， METTL1以酶活性依賴的方式促進了樂伐替尼耐藥表型。

圖2 METTL1通過酶促方式誘導肝癌細胞對樂伐替尼的耐藥

TRAC-seq數據顯示，樂伐替尼耐藥細胞中共有15個tRNAs含有m7G修飾，已確定的m7G修飾的tRNAs的信號在耐藥細胞中被上調（圖3B），同時也觀察到m7G修飾的tRNAs的表達水平增加（圖3C-D）。由于tRNA是翻譯必須的，作者隨后檢測了樣本內蛋白翻譯情況，普羅米辛攝取實驗顯示，耐藥細胞中的全局蛋白新合成增加，并隨著METTL1敲低而減少（圖3E-F）。此外多核糖體分析也顯示，兩種樂伐替尼耐藥細胞中多糖體峰值增加（圖3G-H），進一步支持耐藥細胞中全局mRNA翻譯被上調的發(fā)現(xiàn)。且METTL1敲低后，峰值也被降低（圖3I-J）。此外，過表達野生型METTL1而不是催化無活性的METTL1能促進全局蛋白新合成（圖3K）。

這些數據表明樂伐替尼耐藥細胞的全局mRNA翻譯增加主要是由METTL1通過酶依賴方式介導的。

圖3 METTL1是樂伐替尼耐藥細胞中翻譯活性上調所必需的

在樂瓦替尼耐藥細胞中降低METTL1后，有3921個mRNA的翻譯效率下降（圖4A）。翻譯效率降低的mRNA具有更高的m7G修飾的tRNA解碼密碼子的頻率（圖4B），表明METTL1介導的m7G tRNA修飾以密碼子頻率依賴的機制調節(jié)靶mRNA翻譯。通過GSEA對翻譯效率變低的mRNA進行通路富集情況后發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子（EGFR）途徑的編碼序列（CDS）長度較長（圖4D），與m7G相關的密碼子較多（圖4E），此外，在EGFR途徑中翻譯效率下降的mRNA中，EGFR mRNA具有最豐富的m7G相關密碼子（圖4F），進一步的qPCR實驗證明，表皮生長因子受體mRNA的翻譯效率在兩種樂伐替尼耐藥細胞中都是上調的（圖4G-H）。后續(xù)實驗結果顯示，與親代細胞相比，樂伐替尼耐藥細胞中的EGFR mRNA從單體部分轉移到多體部分（圖4I-J），METTL1沉默時，EGFR mRNA的翻譯效率下降（圖4K-N），且樂伐替尼耐受細胞中的EGFR蛋白表達水平及其下游靶點的磷酸化水平被上調，但在METTL1敲低后則有所下降，活性實驗表明是野生型METTL1在起作用（圖4O-Q）。

上述數據表明，METTL1的缺失可以破壞EGFR的翻譯，抑制耐藥性相關途徑的活性。

圖4 METTL1促進EGFR的翻譯效率

在METTL1抑制細胞中過表達EGFR后，耐藥表型部分回復，表現(xiàn)為在樂伐替尼存在時提高細胞增殖能力和克隆能力（圖5A-C），降低細胞凋亡比例（圖5D-E）。與之相對應的是，在抑制METTL1過表達的細胞中的EGFR后，可部分挽救樂伐替尼的敏感性（圖5F-J）。

上述結果表明， EGFR途徑在METTL1介導的樂伐替尼耐藥性中起著關鍵作用。

圖5 METTLI介導的m7G tRNA修飾通過EGFR誘導樂伐替尼耐藥性

為了驗證METTL1在體內的作用，作者構建了肝癌發(fā)生模型，其中myr-AKT1和N-RasV12原癌基因被睡美人（Sleepy Beauty，SB）轉座酶通過水動力轉染穩(wěn)定地整合到肝細胞的基因組中，誘導HCC腫瘤發(fā)生（圖6A）。小鼠被分為4組，空載組（myr-AKT1/N-RasV12/空載體質粒/SB），有或沒有樂伐替尼治療；METTL1過表達組（myr-AKT1/N-RasV12/Mettl1/SB），有或沒有樂伐替尼治療。

空載組中，樂伐替尼治療減少了腫瘤負擔，表現(xiàn)為腹部大小（圖6B）和肝臟腫瘤病灶（圖6C）的減少，以及肝臟重量（圖6D）和肝臟重量與體重的比率的降低（圖6E），而在METTL1過表達組中，樂伐替尼并無顯著作用。HE和IHC的檢測結果也顯示，在空載組中，樂伐替尼治療導致腫瘤密度的降低，并伴隨著較低的Ki67陽性細胞和EGFR表達水平，然而，METTL1過表達后，上述標志物在樂伐替尼治療下保持不變（圖6F-G）。

上述數據表明，METTL1在誘導體內樂伐替尼耐藥性方面起關鍵作用。

圖6 METTL1的過表達促進樂伐替尼在體內的耐藥

在這項研究中，作者通過體外和體內實驗，發(fā)現(xiàn)了METTL1介導的tRNA m7G修飾通過促進EGFR通路基因的翻譯效率誘導HCC細胞樂伐替尼耐藥，揭示了HCC樂伐替尼耐藥的新機制，并為靶向tRNA甲基化機制來克服HCC中樂伐替尼耐藥提供了強有力的科學依據。