覆盆子（Rubus chingii Hu.）作為傳統(tǒng)中藥，具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目等功效。近年來，覆盆子也被報道具有抗氧化、抗炎、降糖減脂的作用。關于覆盆子的功能成分主要集中于酚類、類黃酮、三萜、礦物質(zhì)、維生素、類胡蘿卜素和有機酸等。值得注意的是，植物多糖也具有極好的健康促進作用，比如抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、減肥、降血糖等。覆盆子多糖目前主要報道具有抗氧化、非酶糖基化抑制、α-淀粉酶抑制和巨噬細胞激活等作用。但是有關覆盆子多糖新成分、新結構和新功能方面的研究較少，而作為極具開發(fā)價值的植物多糖應該更加深入的研究和開發(fā)。
2023年4月18日，來自溫州醫(yī)科大學藥學院鄭宏課題組在國際食品TOP期刊Food Chemistry（IF=9.231）上發(fā)表了題為“A novel polysaccharide from Rubus chingii Hu unripe fruits: Extraction optimization, structural characterization and amelioration of colonic inflammation and oxidative stress. 2023, 421, 136152”的研究性論文。該研究首先采用三步法優(yōu)化了從未成熟覆盆子果實中提取多糖的工藝條件，并通過單糖分析、FT-IR、分子量及均一性分析、甲基化分析和1D/2D NMR分析對多糖主要組成成分（pRCP）進行了詳細的結構表征。隨后，對高脂飲食小鼠進行為期12周的干預實驗，并分析其對腸道菌群、結腸炎癥和氧化應激的影響。最后，將pRCP處理小鼠的腸道微生物群移植給高脂飲食喂養(yǎng)的受體小鼠中，以確認腸道微生物群在pRCP對腸道保護作用中的因果作用。該研究結果表明覆盆子新型多糖pRCP可以作為一種潛在的益生元，通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡來改善腸道炎癥和氧化損傷，保護腸功能健康。
采用水提醇沉法提取覆盆子多糖，選用Sevag法除蛋白、透析脫鹽、陰離子交換層析和凝膠過濾色譜進行分離純化。
利用高效凝膠過濾色譜、高效液相色譜、FT-IR分析、甲基化分析、核磁共振波譜法等多種技術手段對覆盆子多糖進行結構解析。
通過對高脂飲食小鼠進行覆盆子多糖干預以及糞菌移植實驗，揭示覆盆子多糖通過調(diào)控腸道菌群來改善結腸炎癥和氧化應激。
本研究首先采用最優(yōu)提取方法（超聲輔助乙醇浸提法）提取覆盆子粗多糖（RCP）（圖1a），并通過三步法對超聲輔助預處理過程進行了優(yōu)化（圖1c），RCP的提取率可達8.30±0.07%，顯著高于非優(yōu)化提取方法（圖1b）。RCP經(jīng)DEAE Seplife FF纖維素色譜柱和Sephacryl S?400HR色譜柱分離，得到純度為86.03%的覆盆子多糖pRCP（圖2a、2b）。采用苯酚硫酸法和考馬斯亮藍法分別測定多糖和蛋白質(zhì)含量，結果顯示pRCP中多糖含量達44.61％，未檢測到蛋白質(zhì)（表1）。
圖1. RCP的提取過程。
利用高效凝膠過濾色譜、高效液相色譜、FT-IR對多糖進行結構表征。如表1所示，pRCP的單糖組成及比例為：巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸=0.35：39.76：39.43：2.16：1.53：2.56：8.56：5.64。FT-IR光譜分析表明pRCP具有多糖的特征吸收峰（圖2c）。在不同的放大倍數(shù)下，用SEM檢測了pRCP的表面形貌，發(fā)現(xiàn)pRCP具有光滑的表面和多孔的層狀結構，表明pRCP可以用作藥物遞送的包封材料（圖2d）。
圖2. pRCP的純化過程、FT-IR分析以及電鏡掃描分析。
表1. RCP多糖產(chǎn)率以及單糖組成
進一步通過甲基化分析確定了pRCP中的糖苷鍵和糖殘基的摩爾百分比。如表2所示，t-Ara(f)、3-Ara(f)、5Ara(f)和2,5- Ara (f)的摩爾百分比分別為23.059、2.997、11.156和2.446%。pRCP的主要糖苷鍵為t-Gal (p)、3- Gal (p)、4-Gal(p)、6-Gal(p)和3,6- Gal (p)，比例分別為3.477、4.362、5.367、5.782和18.344%。此外，pRCP還由t-Gal(p)-UA和4-Gal(p)-UA組成，其百分比分別為0.386和8.051%。由此可見，pRCP富含阿拉伯糖和半乳糖的糖殘基，與單糖組成分析一致。
表2. pRCP的甲基化和鍵合類型分析
隨后，1D/2D NMR進一步分析pRCP的結構（圖3a-3f），綜合甲基化分析結果，推斷pRCP主要是由→3,6)?β?Galp(1→和→5)?α?Araf(1→形成主鏈，支鏈主要由α?Araf(1→連接在殘基B的3位構成。
圖3. pRCP的結構表征。
為了研究pRCP干預對高脂飲食（HFD）小鼠腸道菌群的影響，給予小鼠正常飼料（Chow）、HFD或HFD+pRCP，為期12周（圖4a）。結果顯示，pRCP干預顯著增加腸道微生物多樣性（圖4b）并且明顯改變HFD小鼠的腸道微生物整體模式（圖4c）。隨后，通過火山圖和韋恩圖分析鑒定7個菌屬在HFD小鼠中顯著變化且pRCP干預后也被顯著調(diào)控（圖4d-4f）。運用熱圖展示這7個菌屬的變化，如圖4g所示，與Chow小鼠相比，HFD小鼠的Erysipelatoclostridium和Negativibacillus的相對豐度顯著增加，但經(jīng)過pRCP干預后，它們的豐度顯著下降。因此，pRCP可以作為一種潛在的益生元，增加HFD小鼠的腸道微生物多樣性，降低有害細菌的豐度。
為了研究pRCP干預對HFD導致的結腸炎癥和氧化應激的影響，本研究分析了pRCP干預后HFD小鼠結腸中的相關炎癥和氧化應激指標。qPCR結果顯示，HFD可顯著增加小鼠結腸中IL-6（圖5a）、IL-1β（圖5b）和TNF-α（圖5c）的表達水平，但經(jīng)pRCP干預后，其表達水平顯著降低。與Chow小鼠相比，HFD小鼠的結腸抗氧化應激指標Sod1（圖5d）、Nqol（圖5e）和Nrf2（圖5f）表達水平顯著降低，pRCP干預后可使其恢復到正常水平。另外，pRCP干預可顯著降低HFD小鼠的結腸促氧化應激指標Acox1（圖5g）和Nox2（圖5h）mRNA表達水平。對于Nox4，與其他兩組相比，pRCP組有輕微但不顯著的降低（圖5i）。之后，采用免疫組化染色法測定小鼠結腸中DNA氧化損傷生物標志物8-羥基-2-脫氧鳥苷（8-OHDG）和氧化應激生物標志物4-羥基壬烯醛（4-HNE）的蛋白水平變化，如圖5j和圖5l所示。定量結果顯示，HFD小鼠結腸中8-OHDG（圖5k）和4-HNE（圖5m）陽性染色強度均顯著增加，經(jīng)pRCP干預后恢復到正常水平。綜上所述，研究結果表明，pRCP具有減輕HFD誘導的小鼠結腸炎癥和氧化損傷的能力。
圖4. pRCP重塑HFD小鼠的腸道菌群。
圖5. pRCP減輕HFD小鼠結腸炎癥和氧化應激。
隨后，我們采用糞菌移植實驗進一步驗證pRCP通過改變腸道菌群對HFD導致的結腸疾病保護作用中的因果關系，如圖6a所示，其中HFD-R小鼠移植HFD小鼠糞菌，pRCP-R小鼠移植pRCP干預小鼠糞菌。結果顯示，與HFD-R小鼠相比，pRCP-R小鼠腸道微生物多樣性明顯增加（圖6b）。PCoA結果顯示，pRCP-R小鼠的腸道微生物模式與HFD-R小鼠的腸道微生物模式明顯分離（圖6c）。隨后，通過火山圖，鑒定出HFD-R和pRCP-R小鼠之間顯著變化的腸道微生物（圖6d）。結果發(fā)現(xiàn)pRCP-R小鼠中Erysipelatoclostridium和Negativibacillus的相對豐度明顯低于HFD-R小鼠。
同樣地，通過qPCR檢測小鼠結腸組織的炎癥和氧化應激相關基因mRNA水平表達情況。結果顯示，與HFD-R小鼠相比，pRCP-R小鼠結腸中炎癥因子的表達水平顯著降低，包括IL-6（圖7a）、IL-1β（圖7b）和TNF-α（圖7c）。與HFD-R小鼠相比，pRCP-R小鼠結腸中Sod1（圖7d）和Nqo1（圖7e）水平略有升高，但不顯著。但是，pRCP-R小鼠的Nrf2水平明顯高于HFD-R小鼠（圖7f）。此外，pRCP-R小鼠結腸中Acox1（圖7g）、Nox2（圖7h）和Nox4（圖7i）的表達水平明顯低于HFD-R小鼠。免疫組化染色進一步證實了這些結果，與HFD-R小鼠相比，pRCP-R小鼠結腸中8-OHDG（圖7j-7k）和4-HNE（圖71-7m）陽性染色強度顯著降低。因此，研究結果表明pRCP可以通過調(diào)控腸道菌群來改善結腸炎癥和氧化損傷。
圖6. FMT改變了HFD小鼠的腸道微生物群。
圖7. FMT可減少HFD小鼠的結腸炎癥和氧化應激。
本研究采用三步法優(yōu)化了從未成熟覆盆子果實中提取多糖的工藝條件，并對多糖主要組成成分（pRCP）進行了詳細的結構表征。報道了pRCP是一種由巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸組成的多鍵酸性雜多糖，其主鏈由→3,6)-β-Galp(1→和→5)a-Araf(1→組成。pRCP表現(xiàn)出較高的均一性，其Mw和Mn分別為74.864和49.187 kDa。此外，發(fā)現(xiàn)pRCP干預可以增加HFD小鼠的腸道微生物多樣性，降低有害細菌的豐度。同時，不管是對高脂飲食小鼠進行覆盆子多糖干預還是糞菌移植實驗均可減輕HFD誘導的小鼠結腸炎癥和氧化應激。因此，pRCP有望作為一種有前景的益生元用于改善HFD引起的腸道微生態(tài)失調(diào)以及結腸炎癥和氧化損傷。
文章鏈接：DOI: 10.1016/j.foodchem.2023.136152
羅浛綺，溫州醫(yī)科大學藥學院2021級藥學碩士，研究方向：覆盆子多糖優(yōu)化制備及其對腸道穩(wěn)態(tài)作用機制研究，目前以第一作者在Food Chemistry、Journal of Proteome Research等SCI期刊發(fā)表論文2篇，申請覆盆子多糖相關國家發(fā)明專利2項。
鄭宏，博士，溫州醫(yī)科大學藥學院副研究員，博士生導師。目前主要從事糖尿病及其并發(fā)癥/合并癥的發(fā)病機制和防治策略研究，具體包括菌群失調(diào)和代謝紊亂在糖尿病及其并發(fā)癥/合并癥中的作用機制研究以及糖尿病功能性食品開發(fā)與運用。截止目前已在Microbiome, Journal of Advanced Research，mSystems，F(xiàn)ood Chemistry等國內(nèi)外相關領域期刊發(fā)表論文70余篇，其中第一或通訊作者論文40余篇，引用超過1800余次，H指數(shù)28；授權國家發(fā)明專利3項；主持國家自然科學基金面上項目、國家自然科學基金青年項目、浙江省公益技術應用研究項目等基金項目7項；作為主要完成人獲得浙江省科技進步獎二等獎、浙江省中醫(yī)藥科學技術獎二等獎等科技獎項3項；入選浙江省“錢江人才計劃”、溫州市科技創(chuàng)新青年拔尖人才等人才項目；指導本科生或研究生獲得國家獎學金、挑戰(zhàn)杯省賽金獎、互聯(lián)網(wǎng)+省賽金獎、全國生命科學競賽二等獎等獎項。
往期推薦
客戶文章|Food&Function：生態(tài)環(huán)境對苜蓿多糖結構特性和生物活性的影響
Front Nutr 一作解讀|添加天竺葵精油的木薯淀粉復合膜相關性能的研究
一作解讀|Foods 火參果 （Cucumis metuliferus） 果皮中果膠的免疫活性和腸道微生物群調(diào)節(jié)
客戶文章|Frontiers in Nutrition.一作解讀：甘油和赤蘚糖醇不同配比對玉米淀粉基薄膜性能的影響
客戶文章|F.C.一作解讀：微波加熱制備淀粉-脂質(zhì)復合物的研究
... ...
