小鼠腎臟、血清

轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)

1.建立CKD肌肉減少癥小鼠模型

用0.2%腺嘌呤飲食喂養(yǎng)10周齡C57BL/6JNifdc小鼠6周后（圖1A），體重和握力逐漸下降，BUN和Scr顯著增加（圖1B，C）。腎臟病理學(xué)分析顯示CKD小鼠腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化明顯（圖1E）。如圖1D所示，與NC組相比，CKD小鼠腓腸肌，脛骨前肌和比目魚肌的重量顯著降低。肌肉的病理學(xué)和橫截面積（CSA）分析表明，CKD小鼠的CSA顯著降低（圖1F）。結(jié)果表明，0.2%腺嘌呤顯著降低了小鼠的腎功能并增加了骨骼肌的損失。

圖1 CKD肌肉減少癥模型

2.CKD小鼠腎臟轉(zhuǎn)錄組和蛋白組及和血清蛋白組分析

基于主成分分析（PCA），腎臟的轉(zhuǎn)錄組和TMT以及血清的TMT清楚地分離了CKD和NC小鼠（圖2A）。結(jié)合來自腎臟轉(zhuǎn)錄組和TMT分析的差異表達(dá)基因（DEG）/DEP，與對照組相比，CKD組中共有503個基因/蛋白質(zhì)被共上調(diào)，377個蛋白質(zhì)/基因被共下調(diào)（圖2B）。隨后，共上調(diào)和共下調(diào)的蛋白質(zhì)/基因分別與血清TMT的上調(diào)和下調(diào)蛋白質(zhì)取交集，NC和CKD組之間腎臟和血清TMT中的29 DEGs/DEPs（圖2D，E）。在與圖2E中CKD腎臟和血清中表達(dá)最多的前10種蛋白質(zhì)取交集后，鑒定到6種蛋白質(zhì)，包括Spp1，S100a9，Hp，Orm1，Ltf和Chil3（圖2F），為CKD誘導(dǎo)的肌肉減少癥提供了潛在的治療靶點。

圖2 CKD小鼠腎臟轉(zhuǎn)錄組和蛋白組及血清轉(zhuǎn)錄組分析

3.蛋白組數(shù)據(jù)揭示CKD小鼠肌肉的分子變化

腓腸肌的TMT蛋白質(zhì)組學(xué)PCA分離CKD和NC小鼠的腓腸肌（圖3A）。火山圖顯示，在CKD和NC小鼠之間檢測到2326種蛋白質(zhì)，其中240種和188種蛋白質(zhì)分別顯著上調(diào)和下調(diào)（圖3B）。熱圖代表CKD小鼠腓腸肌中上調(diào)和下調(diào)蛋白中的前30個DEP（圖3C）。KEGG途徑富集分析表明，包括氧化磷酸化信號傳導(dǎo)途徑，產(chǎn)熱途徑，ECM-受體相互作用途徑，硫代謝，檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）和血小板活化途徑發(fā)生了顯著改變（圖3D）。GSEA顯示氧化磷酸化和TCA循環(huán)途徑顯著下調(diào)，而ECM-受體相互作用和血小板活化途徑顯著上調(diào)（圖3E）。這些結(jié)果表明，參與上述途徑的蛋白質(zhì)失調(diào)與CKD誘導(dǎo)的肌肉減少癥密切相關(guān)。

圖3 蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)揭示CKD小鼠肌肉分子變化

4.腎臟分泌蛋白與骨骼肌最顯著改變的KEGG通路的蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性

假設(shè)腎臟在CKD狀態(tài)下將特定蛋白質(zhì)分泌到血液中，并且這些蛋白質(zhì)可能通過血液循環(huán)導(dǎo)致骨骼肌損失。對篩選出的29種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與Scr，BUN，腓腸肌重量和握力之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，進(jìn)一步將圖2F中的六種蛋白質(zhì)縮小到五種：Spp1，S100a9，Hp，Orm1和Ltf。對血清TMT中的這五種蛋白質(zhì)與肌肉TMT的前六個KEGG途徑中涉及的蛋白質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析，以探索這些蛋白質(zhì)對肌肉功能的潛在影響。血清TMT中S100a9，Hp，Orm1和Ltf的表達(dá)水平與肌肉TMT中氧化磷酸化和產(chǎn)熱途徑中大多數(shù)DEP的變化呈負(fù)相關(guān)，但與肌肉TMT中ECM-受體相互作用途徑中的DEP呈正相關(guān)（圖4A）。血清TMT中的Spp1，S100a9，Hp，Orm1和Ltf水平與TCA周期中的大多數(shù)DEP和肌肉TMT中的血小板活化途徑呈正相關(guān)（圖4A）。血清TMT中的S100a9，Hp，Orm1和Ltf與Selenbp1呈負(fù)相關(guān)，但與肌肉TMT中硫代謝的Sqor呈正相關(guān)（圖4A）。這些結(jié)果闡明了靶蛋白可能參與的途徑。

圖4 腎臟分泌蛋白與骨骼肌最顯著改變的KEGG通路的蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖

5.Spp1和S100a9重組蛋白對體外肌管萎縮的影響

經(jīng)過篩選和文獻(xiàn)綜述，兩種蛋白質(zhì)Spp1和S100a9成為重點目標(biāo)用于研究它們對C2C12肌管的影響。圖5A顯示了細(xì)胞實驗的流程圖。加入S100a9重組蛋白（100 ng/mL）后，atrogin-1的蛋白水平顯著增加（圖S3A）。然而，加入不同濃度的Spp1重組蛋白后，atrogin-1蛋白水平?jīng)]有觀察到差異（圖5B）。分別添加1000 ng/mL Spp1和S100a9重組蛋白后，murf-1蛋白水平顯著增加（圖5B，圖S3A）。免疫熒光染色表明，高濃度的Spp1或S100a9重組蛋白減少了肌管面積（圖5C，圖S3B）。

圖5 Spp1重組蛋白對體外肌管萎縮的影響

6.CKD小鼠模型腎臟、血清和骨骼肌中Spp1的驗證分析

CKD小鼠血清Spp1濃度升高（圖6A），這與骨骼肌質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)（圖6A）。qRT-PCR表明，CKD小鼠腎臟中Spp1 mRNA水平顯著增加（圖6B），WB和免疫組織化學(xué)進(jìn)一步證實了這一點（圖6C，D）。同時，免疫組織化學(xué)顯著增加了CKD患者腎臟中Spp1的表達(dá)水平（圖6E）。還使用WB檢查了骨骼肌中Spp1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NC和CKD小鼠之間沒有差異（圖6C）。因此，腎臟產(chǎn)生的Spp1可能通過血液循環(huán)影響骨骼肌質(zhì)量。

圖6 CKD小鼠模型腎臟、血清和骨骼肌中Spp1的驗證分析

7.Spp1的藥理抑制作用可防止實驗性CKD中的肌肉萎縮

在4周的0.2%腺嘌呤飲食后，CKD小鼠每隔一天通過腹膜內(nèi)注射（100μg/kg）接受一次Spp1中和抗體連續(xù)兩周（圖7A）。用Spp1中和抗體治療可防止CKD小鼠體重減輕（圖7B）。Spp1中和抗體治療2周后，抗Spp1組的握力顯著高于對照IgG組（圖7C）。同時抗Spp1組小鼠腓腸肌和脛骨前肌的重量大于對照IgG組（圖7D）。循環(huán)Spp1的中和降低了CKD小鼠的血液Spp1濃度并輕度改善了血清尿素氮和肌酐水平（圖7E）。與對照IgG小鼠相比，腓腸肌CSA的定量顯示Spp1中和抗體在終末期時間點右移（圖7F）。以上說明Spp1的藥理學(xué)抑制可防止實驗性CKD中的肌肉萎縮。

圖7 藥理學(xué)抑制Spp1可預(yù)防實驗性慢性腎臟病（CKD）中的肌肉消耗

8.轉(zhuǎn)錄組鑒定了Spp1藥理抑制的骨骼肌萎縮標(biāo)志物及其驗證

為了鑒定CKD小鼠肌肉中受Spp1抑制影響的DEG，作者進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，比較CKD小鼠中抗Spp1和對照IgG處理的GC肌肉。根據(jù)PCA，RNA測序分離了抗Spp1和對照IgG組的腓腸肌（圖8A）。火山圖顯示，在這兩組之間檢測到25個201個基因，其中1157個和760個基因分別顯著上調(diào)和下調(diào)（圖8B）。熱圖代表了接受Spp1中和抗體治療后CKD小鼠腓腸肌上調(diào)和下調(diào)基因中的前30個DEG（圖8C）。KEGG途徑富集分析表明，這30條途徑發(fā)生了顯著改變，其中蛋白質(zhì)消化和吸收，胰高血糖素信號通路，apelin信號通路，ECM-受體相互作用和細(xì)胞粘附分子的改變最為顯著（圖8D）。同時驗證了用Spp1中和抗體治療后腓腸肌中骨骼肌萎縮標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Spp1的藥理學(xué)抑制在mRNA和蛋白質(zhì)水平上都改善了肌肉萎縮的標(biāo)志物（atrogin-1和murf-1）（圖8E，F(xiàn)）。這些數(shù)據(jù)為阻斷循環(huán)Spp1增加骨骼肌質(zhì)量的機制提供了線索。

圖8 轉(zhuǎn)錄組分析鑒定出藥理學(xué)抑制Spp1后腓腸肌來源的差異表達(dá)基因（DEGs），并驗證了骨骼肌萎縮標(biāo)志物