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2023.06.16

文獻解讀

文獻解讀|宮頸癌進程的新見解——單細胞核轉錄組與蛋白質組學的聯合發現


背景



宮頸癌（Cervical cancer ，CC）

是女性第三大最常見的癌癥，也是婦科惡性腫瘤的第四大死因，然而CC的確切進展并無定論，主要是因為在腫瘤發生的不同階段，腫瘤微環境的變化非常復雜，且目前還缺乏對不同階段CC患者的腫瘤微環境進行詳細的單核轉錄組比較分析。
2023年1月發表在J Exp Clin Cancer Res上的題為“Single-nucleus RNA sequencing and deep tissue proteomics reveal distinct tumour microenvironment in stage-I and II cervical cancer”的論文，通過對CC I期和CC II期的腫瘤樣本進行單核轉錄組和定量蛋白質組學分析，發現CC II中免疫應答相關信號被抑制，TNF-α和γ反應是CC I許多細胞群中最活躍的途徑，此外，幾種膠原蛋白在CCII組中被發現顯著上調，一種新的轉錄本AC244205.1被檢測為CCII患者中上調最多的基因。





研究材料


四名CC I期患者和三名CC II期患者的腫瘤樣本



技術方法


單細胞核轉錄組，蛋白質組學



實驗路線




研究結果


01
鑒定I期和II期宮頸癌的腫瘤細胞組成


作者首先從I期（n=4）和II期（n=3）供體的腫瘤組織中分理出細胞核進行了snRNA-seq，共有72,128個核被用于后續分析（圖1A-B），結果中顯示了22種細胞類型，通過結果比對發現CC II組中第3、4、9、14、15、16、17、18、19群的比例基本增加，而第2、5、7和20群的比例減少，群組0和3的許多細胞沒有顯示明確的細胞周期標記基因的差異表達（圖1C-D）。隨后作者對整體差異表達的基因進行分析，確定細胞類型特異的標記基因（圖1E）。


圖1 CC I期和CC II期宮頸癌患者腫瘤組織的snRNA-seq分析

02
免疫抑制和促進腫瘤生長的表型在CC II患者TME的巨噬細胞中占主導地位


基因表達結果顯示，CC II組中有122個上調和102個下調的差異基因，MΦ標記基因的表達在CC II組中相對下調。許多趨化因子、細胞因子和白細胞介素在CCI組顯著高表達，包括M1樣MΦ的特征因子，如IL12RB1、IL2RA和IL20RB。與免疫抑制性MΦs相關的基因在CC II組中升高。根據途徑分析結果，上皮-間質轉化（EMT）是CC II組中最豐富的途徑，由膠原蛋白家族成員的上調支持（圖2A-D）。此外，P53途徑、通過NFκB的TNF-α信號和細胞凋亡途徑均在CC II組中被檢測到富集，與細胞骨架的發展相關的幾個途徑也是如此。CC I組中編碼干擾素誘導蛋白的基因的升高支持了IFN-α和IFN-β反應途徑的激活（圖2E）。



圖2 CC I和CC II組的MΦs顯示出不同水平的免疫反應

作者對MΦ亞型進行分析后確定了5個亞型，分別為C0-Res、C1-TAM、C2-M2、C4-M1和C2-M2，差異基因表達情況如圖3A所示。通過比較各亞型中與巨噬細胞功能相關基因的平均表達水平，發現STAT1、HLA-DRB1、TMSB4X、C1QC和FGL2在CC I組的所有亞型中都有較高的表達比例（圖3B）。隨后將MΦ投射到Monocle3定義的二維狀態空間上進行偽時序分析，推斷MΦ發展的線狀軌跡（圖3C），結果顯示該軌跡從C0-Res和C2-M2開始，向不同的方向發展，一個方向通向C3-DC和C4-M1，另一個方向與C1-TAM相連，其分支由C1-TAM、C3-DC和C4-M1組成。


圖3 CCI組和CCII組巨噬細胞異質性分析

03
CC II患者TME中的T細胞功能被抑制


有三種細胞群被鑒定到，分別為CD8+T、γδT和Treg細胞。CD8+T和γδT細胞的數量在不同階段有很大的變化，前者從57%（CC I）增加到80%（CC II），而后者減少了近70%，CC I組患者的Treg細胞數量高于CCII組（圖4A-B）。兩組之間三種T細胞群的分布顯示在2D-tSNE空間中，CD8+T細胞分為五個主要亞型（a、b、c、d和e），其中CC II組的a亞型細胞數量明顯較多，CC I組有更多來自b、c、d和e亞型的細胞。CD8A和PRF1在CD8+T的d亞群中高表達，而高表達CD4和CTLA4的細胞主要在CC I組的Treg細胞中檢測到。IFNGR1和IFNGR2在γδT細胞中表達較多，而IFIT3在CCI組的Treg細胞中表達上調（圖4C）。

三個T細胞群的Top100差異基因如圖4D所示，與激活T細胞免疫反應相關的基因在CC I組的CD8+T中明顯上調，與干擾素反應密切相關基因在CC I的γδT細胞中被上調，與抗原呈遞有關的CD38和CD48的表達在CD8+T和Treg細胞中升高，但在CC I組的γδT細胞中下調。這些觀察結果表明，與CC I組相比，CC II組的T細胞更具有免疫抑制性。

圖4 CC II組患者的T細胞活化較少

04
CC II中的B細胞和DCs的MHC-I類抗原過程被抑制


CC I組有更多的漿細胞樣樹突狀細胞（pDCs），而B細胞在CC II組更豐富（圖5A）。對于CD141+CLECL9A+ DCs 和 pDCs來說，與抗原呈遞相關的差異基因在CC I組中被上調，而CC II組的HLA-B、HLA-A、HLA-C和HLA-DMB的平均表達量更高（圖5B）。生物過程分析結果表明，組織發育信號在CC II組的DCs中被高度激活，但比較與MHC-I類抗原處理相關的差異基因表達表達情況時，發現它們在CCI組的B細胞中被上調（圖5C-D）。CC II組的先天B細胞中COL3A1、COLA1和COLA2被上調（圖5E）。與I型和II型干擾素信號相關的基因在CC I組的B細胞中被上調，IL-18的信號和趨化因子的活性在CC II組的先天B細胞中升高。


圖5 CC I組TME中的B細胞和DCs表現出增強的MHC-I途徑

05
NK細胞在CC I組中更活化


KEGG的富集結果顯示，CC I組的大多數NK細胞表達了更高水平和激活的NK細胞功能正相關的標記基因，調節IL17和TNF信號的基因被CC II組的NK細胞高度表達（圖6A）。GZMA、KLRC1、GZMB和NKG7僅在CC II組的少數NK細胞中表達（圖6B），與趨化因子和細胞因子信號相關的DEGs在CC I組的平均表達量和表達百分比大多升高（圖6C），GSEA結果表明 "自然殺傷細胞介導的細胞毒性 "是CC I組唯一富集的KEGG途徑（圖6D）。

作者隨后分析了NK細胞的亞型，結果顯示CC I組擁有更多的成熟（標記基因PRF1、GZMA、GZMB和CFL1）、CD56bright（KLRC1、NCAM1和GNLY）和末端（WDR74、HIST1H1D和HIST1H1E）NK細胞（圖6E）。兩組NK細胞的發展是根據軌跡分析推斷出來的，共確定了七種狀態，在CC I組檢測到的成熟NK細胞比例較高（圖6F-G），終端NK細胞的比例在狀態1中是第二大的，然后在狀態2和狀態7中隨著時間的推移而減少，而過渡性NK細胞的比例增加。狀態6主要由CD56bright和成熟NK細胞組成。與CC II組相比，CC I組所有狀態下的標記基因的表達都明顯上調，除了狀態5（只包含成熟NK）（圖6H）。

因此，在免疫反應方面，CC I的NK細胞相對于CC II組更活躍。


圖6 NK細胞的功能在CC II患者的TME中受到抑制

06
CC I和CC II患者的癌細胞呈明顯的異質性

腫瘤干細胞（CSCs）的比例在CC II組為24.75%，而在CC I組只有15.63%。所選標記基因的相對表達密度顯示在二維tSNE圖中（圖7A）。一組DEGs（包括CFTR、PROM1、CD55和RHEX）在CSCs中明顯上調，在CC II組中更為明顯，意味著細胞的高度生長（圖7B）。炎癥反應有關的基因以及幾種膠原蛋白，在間充質干細胞中的表達量比其他干細胞高。GSEA顯示，CC I組的CSCs中富集的前6條路徑與免疫反應有關（圖7C），相反，與細胞生長相關的途徑在CC II 的CSCs中被激活。TGFβ和細胞外基質組織的信號在CC II組的脂肪基質細胞（ADSCs）中顯得更加豐富，而在CC I組的ADSCs中檢測到了離子膜運輸的激活（圖7D）。

KEGG結果顯示，多種癌癥相關的信號是基底細胞和上皮細胞富集途徑之一（圖7E和7F）。許多表達角蛋白和膠原蛋白的基因被檢測為四個非干細胞群的頂級差異基因，基因表達情況顯示膠原蛋白普遍上調，除了淋巴內皮細胞外，角質蛋白也是如此（圖7G）。角質細胞顯示大多數角蛋白和膠原蛋白的高表達，膠原蛋白家族的幾個成員在CC II組的多種細胞類型中被上調。這些異常表達與宮頸癌的風險呈正相關，這提示了它們在臨床診斷中的潛在作用。


圖7 腫瘤相關干細胞和上皮細胞在CC I患者中具有更強的免疫應答活性


07
定量蛋白質組學顯示CC II患者存在明顯的免疫抑制現象


作者隨后補充了定量蛋白質組學的分析，結果中有541個差異表達蛋白（圖8A-B）。在CC II組中明顯上調蛋白的相互作用結果顯示，AKT1與其他幾個與細胞外基質發展相關的高程度節點存在相互作用，如FN1、MMP9、PXN、CAT和CUL1（圖8C）。GSEA顯示IFN-α和IFN-β反應在CC I組富集，而通過NFκB的TNFα信號則在CC II組富集（圖8D）。通過比較snRNA-seq分析檢測到的IFN-α反應通路上的差異基因結果，作者發現它們在MΦs、Treg、NK、B細胞和DCs中表達較多，其中MΦs的表達水平最高（圖8E）。在CC II組中，與免疫過程相關的前20個差異蛋白與它們的基因在不同免疫細胞群中的表達相關（圖8F）。S100A8和S100A9的表達在CC II組的大多數細胞類型中被上調，而CD55和PXN在γδT細胞中被明顯上調。

因此，與CC I組相比，CC II中形成了一個更具免疫抑制性的TME。


圖8 CC I和CC II的定量蛋白質組學分析

小結


在這項研究中，作者通過snRNA-seq和Label Free定量蛋白質組學分析，比較研究了I期和II期CC患者的TME。結果顯示，II期CC患者幾乎所有的免疫細胞異質性都受到了很大的影響，其表型具有明顯的免疫抑制性，膠原蛋白可能被用作預后的標志物。這些發現為CC的臨床診斷和免疫治療提供了重要線索，值得進一步研究。

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文字：牛晶晶
圖文排版：荷包蛋&檀檀
審核：三黍市場部




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