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2023.06.16

文獻(xiàn)解讀

文獻(xiàn)解讀|宮頸癌進(jìn)程的新見(jiàn)解——單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)的聯(lián)合發(fā)現(xiàn)


背景



宮頸癌（Cervical cancer ，CC）

是女性第三大最常見(jiàn)的癌癥，也是婦科惡性腫瘤的第四大死因，然而CC的確切進(jìn)展并無(wú)定論，主要是因?yàn)樵谀[瘤發(fā)生的不同階段，腫瘤微環(huán)境的變化非常復(fù)雜，且目前還缺乏對(duì)不同階段CC患者的腫瘤微環(huán)境進(jìn)行詳細(xì)的單核轉(zhuǎn)錄組比較分析。
2023年1月發(fā)表在J Exp Clin Cancer Res上的題為“Single-nucleus RNA sequencing and deep tissue proteomics reveal distinct tumour microenvironment in stage-I and II cervical cancer”的論文，通過(guò)對(duì)CC I期和CC II期的腫瘤樣本進(jìn)行單核轉(zhuǎn)錄組和定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CC II中免疫應(yīng)答相關(guān)信號(hào)被抑制，TNF-α和γ反應(yīng)是CC I許多細(xì)胞群中最活躍的途徑，此外，幾種膠原蛋白在CCII組中被發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)，一種新的轉(zhuǎn)錄本AC244205.1被檢測(cè)為CCII患者中上調(diào)最多的基因。





研究材料


四名CC I期患者和三名CC II期患者的腫瘤樣本



技術(shù)方法


單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組學(xué)



實(shí)驗(yàn)路線




研究結(jié)果


01
鑒定I期和II期宮頸癌的腫瘤細(xì)胞組成


作者首先從I期（n=4）和II期（n=3）供體的腫瘤組織中分理出細(xì)胞核進(jìn)行了snRNA-seq，共有72,128個(gè)核被用于后續(xù)分析（圖1A-B），結(jié)果中顯示了22種細(xì)胞類(lèi)型，通過(guò)結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)CC II組中第3、4、9、14、15、16、17、18、19群的比例基本增加，而第2、5、7和20群的比例減少，群組0和3的許多細(xì)胞沒(méi)有顯示明確的細(xì)胞周期標(biāo)記基因的差異表達(dá)（圖1C-D）。隨后作者對(duì)整體差異表達(dá)的基因進(jìn)行分析，確定細(xì)胞類(lèi)型特異的標(biāo)記基因（圖1E）。


圖1 CC I期和CC II期宮頸癌患者腫瘤組織的snRNA-seq分析

02
免疫抑制和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的表型在CC II患者TME的巨噬細(xì)胞中占主導(dǎo)地位


基因表達(dá)結(jié)果顯示，CC II組中有122個(gè)上調(diào)和102個(gè)下調(diào)的差異基因，MΦ標(biāo)記基因的表達(dá)在CC II組中相對(duì)下調(diào)。許多趨化因子、細(xì)胞因子和白細(xì)胞介素在CCI組顯著高表達(dá)，包括M1樣MΦ的特征因子，如IL12RB1、IL2RA和IL20RB。與免疫抑制性MΦs相關(guān)的基因在CC II組中升高。根據(jù)途徑分析結(jié)果，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是CC II組中最豐富的途徑，由膠原蛋白家族成員的上調(diào)支持（圖2A-D）。此外，P53途徑、通過(guò)NFκB的TNF-α信號(hào)和細(xì)胞凋亡途徑均在CC II組中被檢測(cè)到富集，與細(xì)胞骨架的發(fā)展相關(guān)的幾個(gè)途徑也是如此。CC I組中編碼干擾素誘導(dǎo)蛋白的基因的升高支持了IFN-α和IFN-β反應(yīng)途徑的激活（圖2E）。



圖2 CC I和CC II組的MΦs顯示出不同水平的免疫反應(yīng)

作者對(duì)MΦ亞型進(jìn)行分析后確定了5個(gè)亞型，分別為C0-Res、C1-TAM、C2-M2、C4-M1和C2-M2，差異基因表達(dá)情況如圖3A所示。通過(guò)比較各亞型中與巨噬細(xì)胞功能相關(guān)基因的平均表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)STAT1、HLA-DRB1、TMSB4X、C1QC和FGL2在CC I組的所有亞型中都有較高的表達(dá)比例（圖3B）。隨后將MΦ投射到Monocle3定義的二維狀態(tài)空間上進(jìn)行偽時(shí)序分析，推斷MΦ發(fā)展的線狀軌跡（圖3C），結(jié)果顯示該軌跡從C0-Res和C2-M2開(kāi)始，向不同的方向發(fā)展，一個(gè)方向通向C3-DC和C4-M1，另一個(gè)方向與C1-TAM相連，其分支由C1-TAM、C3-DC和C4-M1組成。


圖3 CCI組和CCII組巨噬細(xì)胞異質(zhì)性分析

03
CC II患者TME中的T細(xì)胞功能被抑制


有三種細(xì)胞群被鑒定到，分別為CD8+T、γδT和Treg細(xì)胞。CD8+T和γδT細(xì)胞的數(shù)量在不同階段有很大的變化，前者從57%（CC I）增加到80%（CC II），而后者減少了近70%，CC I組患者的Treg細(xì)胞數(shù)量高于CCII組（圖4A-B）。兩組之間三種T細(xì)胞群的分布顯示在2D-tSNE空間中，CD8+T細(xì)胞分為五個(gè)主要亞型（a、b、c、d和e），其中CC II組的a亞型細(xì)胞數(shù)量明顯較多，CC I組有更多來(lái)自b、c、d和e亞型的細(xì)胞。CD8A和PRF1在CD8+T的d亞群中高表達(dá)，而高表達(dá)CD4和CTLA4的細(xì)胞主要在CC I組的Treg細(xì)胞中檢測(cè)到。IFNGR1和IFNGR2在γδT細(xì)胞中表達(dá)較多，而IFIT3在CCI組的Treg細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)（圖4C）。

三個(gè)T細(xì)胞群的Top100差異基因如圖4D所示，與激活T細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)的基因在CC I組的CD8+T中明顯上調(diào)，與干擾素反應(yīng)密切相關(guān)基因在CC I的γδT細(xì)胞中被上調(diào)，與抗原呈遞有關(guān)的CD38和CD48的表達(dá)在CD8+T和Treg細(xì)胞中升高，但在CC I組的γδT細(xì)胞中下調(diào)。這些觀察結(jié)果表明，與CC I組相比，CC II組的T細(xì)胞更具有免疫抑制性。

圖4 CC II組患者的T細(xì)胞活化較少

04
CC II中的B細(xì)胞和DCs的MHC-I類(lèi)抗原過(guò)程被抑制


CC I組有更多的漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（pDCs），而B(niǎo)細(xì)胞在CC II組更豐富（圖5A）。對(duì)于CD141+CLECL9A+ DCs 和 pDCs來(lái)說(shuō)，與抗原呈遞相關(guān)的差異基因在CC I組中被上調(diào)，而CC II組的HLA-B、HLA-A、HLA-C和HLA-DMB的平均表達(dá)量更高（圖5B）。生物過(guò)程分析結(jié)果表明，組織發(fā)育信號(hào)在CC II組的DCs中被高度激活，但比較與MHC-I類(lèi)抗原處理相關(guān)的差異基因表達(dá)表達(dá)情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)贑CI組的B細(xì)胞中被上調(diào)（圖5C-D）。CC II組的先天B細(xì)胞中COL3A1、COLA1和COLA2被上調(diào)（圖5E）。與I型和II型干擾素信號(hào)相關(guān)的基因在CC I組的B細(xì)胞中被上調(diào)，IL-18的信號(hào)和趨化因子的活性在CC II組的先天B細(xì)胞中升高。


圖5 CC I組TME中的B細(xì)胞和DCs表現(xiàn)出增強(qiáng)的MHC-I途徑

05
NK細(xì)胞在CC I組中更活化


KEGG的富集結(jié)果顯示，CC I組的大多數(shù)NK細(xì)胞表達(dá)了更高水平和激活的NK細(xì)胞功能正相關(guān)的標(biāo)記基因，調(diào)節(jié)IL17和TNF信號(hào)的基因被CC II組的NK細(xì)胞高度表達(dá)（圖6A）。GZMA、KLRC1、GZMB和NKG7僅在CC II組的少數(shù)NK細(xì)胞中表達(dá)（圖6B），與趨化因子和細(xì)胞因子信號(hào)相關(guān)的DEGs在CC I組的平均表達(dá)量和表達(dá)百分比大多升高（圖6C），GSEA結(jié)果表明 "自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 "是CC I組唯一富集的KEGG途徑（圖6D）。

作者隨后分析了NK細(xì)胞的亞型，結(jié)果顯示CC I組擁有更多的成熟（標(biāo)記基因PRF1、GZMA、GZMB和CFL1）、CD56bright（KLRC1、NCAM1和GNLY）和末端（WDR74、HIST1H1D和HIST1H1E）NK細(xì)胞（圖6E）。兩組NK細(xì)胞的發(fā)展是根據(jù)軌跡分析推斷出來(lái)的，共確定了七種狀態(tài)，在CC I組檢測(cè)到的成熟NK細(xì)胞比例較高（圖6F-G），終端NK細(xì)胞的比例在狀態(tài)1中是第二大的，然后在狀態(tài)2和狀態(tài)7中隨著時(shí)間的推移而減少，而過(guò)渡性NK細(xì)胞的比例增加。狀態(tài)6主要由CD56bright和成熟NK細(xì)胞組成。與CC II組相比，CC I組所有狀態(tài)下的標(biāo)記基因的表達(dá)都明顯上調(diào)，除了狀態(tài)5（只包含成熟NK）（圖6H）。

因此，在免疫反應(yīng)方面，CC I的NK細(xì)胞相對(duì)于CC II組更活躍。


圖6 NK細(xì)胞的功能在CC II患者的TME中受到抑制

06
CC I和CC II患者的癌細(xì)胞呈明顯的異質(zhì)性

腫瘤干細(xì)胞（CSCs）的比例在CC II組為24.75%，而在CC I組只有15.63%。所選標(biāo)記基因的相對(duì)表達(dá)密度顯示在二維tSNE圖中（圖7A）。一組DEGs（包括CFTR、PROM1、CD55和RHEX）在CSCs中明顯上調(diào)，在CC II組中更為明顯，意味著細(xì)胞的高度生長(zhǎng)（圖7B）。炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因以及幾種膠原蛋白，在間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)量比其他干細(xì)胞高。GSEA顯示，CC I組的CSCs中富集的前6條路徑與免疫反應(yīng)有關(guān)（圖7C），相反，與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的途徑在CC II 的CSCs中被激活。TGFβ和細(xì)胞外基質(zhì)組織的信號(hào)在CC II組的脂肪基質(zhì)細(xì)胞（ADSCs）中顯得更加豐富，而在CC I組的ADSCs中檢測(cè)到了離子膜運(yùn)輸?shù)募せ睿▓D7D）。

KEGG結(jié)果顯示，多種癌癥相關(guān)的信號(hào)是基底細(xì)胞和上皮細(xì)胞富集途徑之一（圖7E和7F）。許多表達(dá)角蛋白和膠原蛋白的基因被檢測(cè)為四個(gè)非干細(xì)胞群的頂級(jí)差異基因，基因表達(dá)情況顯示膠原蛋白普遍上調(diào)，除了淋巴內(nèi)皮細(xì)胞外，角質(zhì)蛋白也是如此（圖7G）。角質(zhì)細(xì)胞顯示大多數(shù)角蛋白和膠原蛋白的高表達(dá)，膠原蛋白家族的幾個(gè)成員在CC II組的多種細(xì)胞類(lèi)型中被上調(diào)。這些異常表達(dá)與宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，這提示了它們?cè)谂R床診斷中的潛在作用。


圖7 腫瘤相關(guān)干細(xì)胞和上皮細(xì)胞在CC I患者中具有更強(qiáng)的免疫應(yīng)答活性


07
定量蛋白質(zhì)組學(xué)顯示CC II患者存在明顯的免疫抑制現(xiàn)象


作者隨后補(bǔ)充了定量蛋白質(zhì)組學(xué)的分析，結(jié)果中有541個(gè)差異表達(dá)蛋白（圖8A-B）。在CC II組中明顯上調(diào)蛋白的相互作用結(jié)果顯示，AKT1與其他幾個(gè)與細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)展相關(guān)的高程度節(jié)點(diǎn)存在相互作用，如FN1、MMP9、PXN、CAT和CUL1（圖8C）。GSEA顯示IFN-α和IFN-β反應(yīng)在CC I組富集，而通過(guò)NFκB的TNFα信號(hào)則在CC II組富集（圖8D）。通過(guò)比較snRNA-seq分析檢測(cè)到的IFN-α反應(yīng)通路上的差異基因結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)它們?cè)贛Φs、Treg、NK、B細(xì)胞和DCs中表達(dá)較多，其中MΦs的表達(dá)水平最高（圖8E）。在CC II組中，與免疫過(guò)程相關(guān)的前20個(gè)差異蛋白與它們的基因在不同免疫細(xì)胞群中的表達(dá)相關(guān)（圖8F）。S100A8和S100A9的表達(dá)在CC II組的大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中被上調(diào)，而CD55和PXN在γδT細(xì)胞中被明顯上調(diào)。

因此，與CC I組相比，CC II中形成了一個(gè)更具免疫抑制性的TME。


圖8 CC I和CC II的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

小結(jié)


在這項(xiàng)研究中，作者通過(guò)snRNA-seq和Label Free定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，比較研究了I期和II期CC患者的TME。結(jié)果顯示，II期CC患者幾乎所有的免疫細(xì)胞異質(zhì)性都受到了很大的影響，其表型具有明顯的免疫抑制性，膠原蛋白可能被用作預(yù)后的標(biāo)志物。這些發(fā)現(xiàn)為CC的臨床診斷和免疫治療提供了重要線索，值得進(jìn)一步研究。

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文字：牛晶晶
圖文排版：荷包蛋&檀檀
審核：三黍市場(chǎng)部




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