炎癥是對(duì)感染、組織損傷或有害刺激的典型防御反應(yīng)。但炎癥過度會(huì)導(dǎo)致慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展。許多疾病與過度炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、肝硬化、糖尿病和癌癥等。傳統(tǒng)的治療藥物有阿司匹林和糖皮質(zhì)激素等，但長期使用會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。研究表明，天然來源的化合物具有干預(yù)炎癥性疾病的獨(dú)特生物活性，例如多酚、類黃酮和多糖。值得注意的是，多糖在保護(hù)機(jī)體免受炎性細(xì)胞因子攻擊方面表現(xiàn)出良好的性能。因此，它們被認(rèn)為是值得進(jìn)一步研究的抗炎候選物。
近日，湖北中醫(yī)藥大學(xué)劉洪濤教授團(tuán)隊(duì)在生物大分子領(lǐng)域的國際期刊《International Journal of Biological Macromolecules》（Top一區(qū)）發(fā)表了題為“Structural characterization and anti-inflammatory activity of polysaccharides from Astragalus membranaceus”（DOI：10.1016/j.ijbiomac.2023.124386）的研究性論文。該研究使用DEAE-52纖維素和Sephadex G-100柱層析從黃芪中分離出兩種新的均一多糖（APS-A1和APS-B1），并通過HPGPC、HPLC、UV-Vis、FT-IR、甲基化分析、GC-MS和NMR光譜等技術(shù)對(duì)二者進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，同時(shí)基于LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞證實(shí)了它們的抗炎活性及其作用機(jī)制。該研究表明黃芪均一多糖在抗炎方面的潛力，同時(shí)揭示了中藥黃芪發(fā)揮抗炎活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。
采用水提醇沉法提取黃芪多糖，選用Sevag法除蛋白、透析脫鹽、陰離子交換層析、凝膠過濾色譜對(duì)黃芪多糖進(jìn)行分離純化。
綜合運(yùn)用高效凝膠過濾色譜、高效液相色譜、甲基化分析、GC-MS、紅外光譜、紫外-可見光譜、核磁共振波譜法等現(xiàn)代儀器分析方法對(duì)黃芪多糖純化組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，確定它們的多糖結(jié)構(gòu)。
基于LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型，評(píng)估了黃芪均一多糖組分的抗炎活性和藥效學(xué)機(jī)制。
本研究采用熱水提取、乙醇沉淀、Sevag法脫蛋白、透析、凍干等方法，從蒙古黃芪中提取黃芪多糖（APS），得率為3.29%。APS經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-100凝膠柱分離，得到兩個(gè)均一多糖組分，APS-A1和APS-B1。含量分析表明APS的總糖含量為64.03%，蛋白質(zhì)含量為9.04%。純化后的APS-A1總糖含量達(dá)到99.48%，為中性多糖。APS-B1總糖為97.51%，糖醛酸含量為1.16%，表明APS-B1為弱酸性多糖。同時(shí)，APS-A1和APS-B1中未檢測到蛋白質(zhì)和還原糖。
圖1. APS的提取和純化過程。
綜合運(yùn)用高效凝膠過濾色譜、高效液相色譜、紅外光譜、紫外-可見光譜對(duì)均一多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明，APS-A1和APS-B1的平均分子量分別為2.62 × 106 Da和4.95 × 106 Da。APS-A1主要由葡萄糖組成，APS-B1主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，摩爾比為75.2∶17.3∶19.4。FT-IR光譜展示了APS-A1和APS-B1具有多糖化學(xué)鍵和官能團(tuán)的特征吸收峰，并證實(shí)含有α型糖苷鍵。紫外-可見光譜表明它們不含核酸和蛋白質(zhì)，與化學(xué)分析的結(jié)果一致。
圖2. APS-A1和APS-B1的理化性質(zhì)和光譜分析。
為了進(jìn)一步獲得有關(guān)它們結(jié)構(gòu)的信息，通過甲基化和GC-MS鑒定了糖苷鍵類型。結(jié)果顯示，APS-A1主要含有T-Glcp、1，4-Glcp和1，4，6-Glcp 3種糖殘基，摩爾比為1.87∶9.93∶1.00。APS-B1包含5種殘基，分別是1，5-Araf、T-Glcp、1，4-Glcp、1，6-Galp和1，4，6-Glcp殘基，摩爾比為0.24∶1.89∶11.08∶1.03∶1.00。
表1. APS-A1和APS-B1的甲基化分析結(jié)果
為了進(jìn)一步解析APS-A1和APS-B1的結(jié)構(gòu)，通過1D-NMR（1H和13C）和2D-NMR（COSY、HSQC和HMBC）進(jìn)行了分析，并結(jié)合甲基化分析結(jié)果，推測了它們的可能結(jié)構(gòu)。APS-A1的骨架是1，4-連接的α-Glcp，一些1，4-連接的α-Glcp的O-6處連有α/β-Glcp殘基附著在主干上。APS-B1的骨架是1，4-連接的α-Glcp，夾雜著1，5-連接的α-Araf，一些1，4-連接的α-Glcp的O-6處有1，6-連接的α-Galp，這些末端被α/β-Glcp殘基取代形成分支。
圖3. APS-A1的NMR。
圖4. APS-B1的NMR。
圖5. APS-A1和APS-B1的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
基于LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞模型，進(jìn)一步研究了黃芪均一多糖的抗炎活性。研究表明APS-A1和APS-B1在體外具有良好的抗炎活性，可以抑制炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和MCP-1）的表達(dá)和分泌，其機(jī)制是抑制NF-κB和MAPKs（ERK，JNK）信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。
圖7. APS-A1和APS-B1對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NLRP3、iNOS、COX-2蛋白表達(dá)和MAPK信號(hào)通路的抑制作用。
圖8. APS-A1和APS-B1對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響。
在本研究中，從黃芪中分離得到兩種均一的多糖APS-A1和APS-B1，并對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。同時(shí)證明二者具有良好的抗炎活性，可以通過抑制NF-κB和MAPK（ERK，JNK）信號(hào)通路，抑制炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和MCP-1）的表達(dá)和分泌。這些結(jié)果表明APS-A1和APS-B1具有良好的抗炎活性，可以作為一種潛在的抗炎補(bǔ)充劑。二者活性的差異可能與其結(jié)構(gòu)特征有關(guān)，進(jìn)一步的研究將集中在它們的生物活性和構(gòu)效關(guān)系上。
文章鏈接：DOI：10.1016/j.ijbiomac.2023.124386
陳廣明，湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2020級(jí)中藥學(xué)碩士，中共黨員。目前已發(fā)表SCI論文3篇，其中第一作者發(fā)表1篇。
劉洪濤，湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師。中國科學(xué)院“百人計(jì)劃”擇優(yōu)支持者，湖北中醫(yī)藥大學(xué)領(lǐng)軍人才，湖北省高層次人才計(jì)劃特聘教授，“湖北省政府專項(xiàng)津貼”專家。目前已發(fā)表論文70余篇，其中SCI論文50余篇，申報(bào)國家發(fā)明專利20余項(xiàng)（授權(quán)5項(xiàng)），先后主持承擔(dān)國家十三五重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目、湖北省科技廳專項(xiàng)、武漢市科技局應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目、企業(yè)合作項(xiàng)目及各類校級(jí)項(xiàng)目共計(jì)16項(xiàng)，主編學(xué)術(shù)著作4部。
現(xiàn)任中國醫(yī)藥教育協(xié)會(huì)微生態(tài)與健康教育專業(yè)委員會(huì)副主任委員、中國醫(yī)師協(xié)會(huì)基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)常務(wù)委員、中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)科研院所工作委員會(huì)常務(wù)委員、中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)無菌動(dòng)物專業(yè)委員會(huì)委員、中國生物工程學(xué)會(huì)糖專業(yè)委員會(huì)委員、中國生物工程學(xué)會(huì)青年委員、中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)脂質(zhì)與脂蛋白專業(yè)委員會(huì)青年委員、湖北省藥理學(xué)會(huì)理事、中國生物檢測監(jiān)測產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟理事、湖北省生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)自然醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥工程專業(yè)委員會(huì)委員。
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