研究者對84個配對樣本進行全外顯子測序，74個腫瘤和57個癌旁進行LF蛋白組，28個腫瘤和21個癌旁進行磷酸化蛋白組，26個腫瘤和16個癌旁進行轉錄組分析（圖1a），發現了15個TFE3的融合配體（圖1b），其中，PTPN12、ZNF627、EWSR1、PARP14、KHSRP、MATR3、RBM10、U2AF2和VCP是本隊列中觀察到的罕見TFE3融合配體。外顯子測序結果中，BCDIN3D、NDRG1、ZNF668和GNPTG被確定為tRCC的顯著突變基因（圖1c）。蛋白組結果顯示，共檢測到14073個蛋白質，在腫瘤組織中有1487個特異蛋白，癌旁組織中有1115個特異蛋白（圖1d），還鑒定到6469個磷酸化蛋白（圖1e）。轉錄組測序確定了13313個基因，與蛋白組的Spearman相關性系數為0.39。基因富集分析顯示，與mRNA-蛋白質正相關的基因富集于腎臟升高蛋白，Gly/Ser/Thr代謝和細胞基質受體相互作用，而負相關的基因富集于蛋白體和氧化磷酸化（圖1f）。

圖1 MiT家族tRCC的分子譜分析

PCA分析結果顯示，兩組樣本在轉錄組（圖2a）、蛋白組（圖2b）、磷酸化蛋白組水平上都有顯著區別。其中，TFE3的上調僅在蛋白水平上被觀察到，而mRNA水平并無變化（圖2c），TFE3的活性在腫瘤中也顯著上調，且與腎臟特征呈負相關，表明TFE3在tRCC中腎臟特征的喪失起重要作用。

蛋白組水平上，腫瘤組織中有836個上調蛋白，891個下調蛋白（圖2d），分別被富集到如圖2e所示的通路中。轉錄組水平上，腫瘤組織中有1626個上調基因，1247個下調基因，且差異基因所富集到的代謝通路與蛋白質水平有一致性，但在mTOR信號和氧化磷酸化（OXPHOS）中，mRNA和蛋白質的表達存在顯著的解偶聯（圖2f-g）。通過分析蛋白組數據，研究者篩選了22個候選的tRCC biomarker（圖2h-i），其中DST和TBK1可作為區分tRCC和其他腎臟惡性腫瘤的潛在biomarker。此外，221個位點在腫瘤組織中顯著上調，RPS6KB1是mTOR的一個重要效應器，該結果進一步支持了mTOR途徑作為tRCC的潛在靶標，Trilaciclib是FDA批準的針對CDK5的藥物，是治療tRCC的潛在方法（圖2j-k）。

圖2 tRCC腫瘤的分子改變

為了確定內源和外源性誘變劑對tRCC基因的影響，研究者隨后使用非負矩陣分解法研究了突變譜，確定了4個與腫瘤突變負擔相關的突變特征，其中只有SBS6與染色體不穩定性和無進展生存期（PFS）有關，且在有SBS6的腫瘤中，DNA修復相關蛋白的表達量明顯下調（圖3a-d）。蛋白組數據分析結果顯示，SBS6與OXPHOS呈負相關，與氧化損傷呈正相關，OXPHOS是線粒體功能的指標，線粒體受損后會導致ROS水平升高，從而誘發細胞氧化損傷，SBS6腫瘤中谷胱甘肽（GSH）合成相關酶受損，進一步加強了SBS6與tRCC氧化損傷的關聯（圖3e-g）。

綜上，在SBS6特征的tRCC腫瘤中，線粒體功能障礙引起的ROS、GSH合成受損、DNA修復缺陷和DNA損傷增加造成了潛在的自我傳播循環（圖3h）。

圖3 突變特征和相關信號通路的鑒定

研究者使用GISTIC鑒定了tRCC的體細胞拷貝數改變（SCNAs），確定了14個arm-level SCNAs，1p染色體上的細胞帶包含頻繁的刪除焦點區域，1q21.1是唯一的擴增事件（圖4a-b）。Cox回歸結果顯示6q和3p的缺失與總生存期（OS）下降相關，進一步的GSEA分析證明與3p拷貝數正相關的蛋白集中在吞噬作用上，負相關的集中在補體和凝血級聯上（圖4c-d）。在3p缺失的tRCC腫瘤中，參與自噬的蛋白被下調，與自噬負相關的ULKI S469磷酸化被上調(圖4e)。自噬基因ATG7的豐度也被發現與MHC-II分子豐度呈正相關(圖4f)。3p中另一個重要順式效應發生在CTNNB1中，它是cadherin-catenin復合物的一部分，cadherin-catenin復合體大多數成分的下調與較差的PFS有關（圖4g）。

綜上，由于ATG7和CTNNB1上的順式作用元件，3p缺失與免疫逃避和轉移有關（圖4h）。

圖4 tRCC隊列中的體細胞拷貝數改變分析

MiT家族tRCC中，TFE3融合瘤更具有侵略性，而TFEB融合瘤的預后較好。通過比對蛋白組數據，有20個蛋白在TFE3-tRCC中上調，518個在TFEB-tRCC中上調，TFEB豐度和活性在兩組內存在顯著差異，而TFE3并無類似差異（圖5a-c）。富集分析結果顯示，TFEB-tRCC中的糖酵解、葡萄糖生成、中性粒細胞脫顆粒、內吞作用、壞死作用和膜運輸都被上調，鈣調蛋白依賴性蛋白激酶的激活在TFE3-tRCC中被上調（圖5d）。

在TFE3的不同融合類型中，上調蛋白、TFE3活性和腎臟特征均有所不同，其中ASPSCR1和LUC7L3的TFE3活性較高，而腎臟特征分數較低，證明這兩種類型的融合瘤更具侵略性，且有更高的ISUP等級（圖5e-i）。

圖5 不同融合類型tRCC的分子異質性

tRCC被分為三個亞型（GP1、GP2和GP3），GP1的III&IV期腫瘤比例最高，而GP2的I&II期腫瘤比例最高。不同亞型在OS和PFS方面存在明顯差異，GP1顯示出最短的OS和PFS，GP3有較短的PFS但較長的OS，與此相對應，86.5%最終出現復發或轉移的患者屬于GP1和GP3（圖6a-b），GP2的腎臟特征得分最高（圖6c）。

通過比較基因組信息，9q和14q的缺失更頻繁地發生在GP1，而12p和12q擴增則聚集在GP1和GP3。由于9q缺失是GP1的重要CNA特征，研究者隨后分析了9q缺失的分子特征，GSEA分析顯示，補體激活在9q缺失的腫瘤中被富集，而OXPHOS在沒有9q缺失的腫瘤中被富集（圖6d-e）。ATP6V1G1（9q32）顯示出明顯的RNA順式效應，其豐度與臨床結果也顯著相關（圖6f-g）。因此，9q基因缺失可能導致順式和反式作用的OXPHOS下調，進一步影響了患者的臨床結果。

圖6 tRCC的蛋白質組亞型及其與遺傳特征和臨床結果的關系

本文使用86份配對樣本，通過分析不同樣本集的基因組學、轉錄組學、Label Free蛋白質組學和磷酸化修飾蛋白質組學數據，揭示了有缺陷的DNA修復在tRCC致癌和進展中起著重要作用，代謝過程在mRNA和蛋白質水平上都明顯失調，蛋白質組學和磷酸化蛋白質組數據還將mTOR信號通路確定為潛在的治療靶點，該項研究結果為tRCC的生物學基礎、疾病診斷、預后評估和治療選擇提供了新的見解。