苜蓿是一種廣泛培養的耐鹽、雙用途作物，因其豐富和高質量的PS（植物多糖）而被廣泛用作食品和飼料，而PS是植物的主要代謝物，參與了細胞壁的形成。有前期研究表明，苜蓿(APS)的PS主要由GalA（57.11%）、Glc（16.42%）和Ara（6.19%）組成，具有抗氧化和免疫調節生物活性。其中Ara是一種生態敏感分子，其在植物的合成中受到生態和環境條件的影響。Ara的生物合成被證明是擬南芥抗鹽脅迫的關鍵途徑，土壤鹽度是最常見的非生物脅迫信號，可以通過觸發細胞內成分的生物合成來增強植物的耐逆能力。然而，鹽堿土對苜蓿PS組成和生物活性的影響機制尚不清楚。因此，研究鹽堿土對APS結構特性的影響，對于靶向分離和具有所需生物活性的功能性PS的應用具有至關重要的意義
2022年5月24日，山東農業大學張桂國團隊在Food Function（IF=6.317）雜志上發表題為“Influence of the ecological environment on the structural characteristics and bioactivities of polysaccharides from alfalfa”的研究論文。該論文解析了來源于正常土壤APS1和鹽堿土壤APS2多糖結構，并研究了其細胞毒性及抗成脂作用。可知，生態環境影響了APS的結構特征和生物功能，使其成為通過功能性食品抗成脂的潛在候選者，這些研究結果為考慮生長環境條件來選擇具有特殊生物活性的植物源性多糖提供了一個新的視角。多糖的結構解析部分由我司完成。
研究材料
正常土壤苜蓿（APS1） 鹽堿地土壤苜蓿(APS2)
實驗路線
研究結果
1 APS的微觀形態和單糖組成
圖1 兩種APS的電鏡掃描圖像
圖2 兩種APS的單糖檢測
在本研究中，APS1和APS2均表現出明顯的聚集和沉淀特征，APS粉質地均勻，表面平坦。分解外表面后，在電鏡掃描下可以觀察到交聯網絡或蜂窩狀微觀結構。單糖組成分析可得，兩種APS類型中均存在7種單糖和2種糖醛酸， 主要成分為Ara、Gal和GalA，兩種APS含有相同的單糖組成但含量略有不同。(圖1-2)
2 APS的紅外光譜及分子量結果
圖3 兩種APS傅里葉變換-紅外光譜
從圖中可知：APS1和APS2的透光光譜相似，但變化較小，波數主要分布在400~4000cm-1之間。APS在2917cm-1處1609cm-1處以及1424cm-1處和10801cm-1均有糖類的特征吸收。
表2不同APS的分子量、多分散性和均方根
圖4. APS的絕對分子量和分子構型圖
APS的摩爾質量、變化趨勢和構象特征如表2和圖4所示。從表中可以看出APS1的摩爾質量更大但質量變化范圍更小。APS1構象圖的斜率小于APS2，說明APS1和APS2與高度分支化的植物大分子均表現出復雜的交聯。（表2 圖4）
3 APS的糖苷鍵與核磁結果
表3 兩種APS糖類殘基之間的糖苷鍵及其摩爾比例
GCMS分析結果表明，APS1和APS2分別有9個和7個不同的糖苷殘基，主要由GalA、Ara、Gal和Glc組成。APS2的Ara和GalA殘基比顯著高于APS1.這一發現進一步證實了Ara 和GalA是生態敏感成分，且苜蓿在鹽堿脅迫下的二者合成得到增強 。
圖5 兩種APS的核磁共振(NMR)圖譜
通過核磁共振分析進一步研究了APS1和APS2中糖基殘基之間的關系，包括一維1H，13C 和以及二維HSQC、COSY、HMBC和NOESY譜。通過核磁圖譜的分析，其重復單元如表4所示。
表4.APS的糖殘基化學歸屬
圖6 兩種APS的重復單元和分子構象
通過上述結構參數，預測了APS1和APS2潛在的三維分子結構。APS1和APS2的重復單元均由Gal、GalA、Glc和Ara組成，單摩爾比略有不同。結合分子量結果，可以推斷APS1和APS2分別包含41和22個重復單元，說明兩者都是長鏈大分子。
此外，三維空間結構功能結果顯示，APS1和APS2的重復單元緊密相連，且高度分支通過透射電鏡檢測了APS1和APS2的整體形狀輪廓和空間構象，APS1展開的部分分子表現出具有分支結構的交聯網或網格模式，而APS2在SDS溶液中似乎是一個隨機線圈。（圖6）
4 APS1和APS2的細胞毒性和抗成脂作用
圖7 APS在3T3-L1細胞中的抗成脂作用及其潛在機制
APS1和 APS2處理均能顯著抑制3T3L1細胞的脂肪生成和脂質積累且APS2作用優于APS1。
接著，作者評估了在3T3-L1細胞中，APS處理后脂肪細胞標記基因的轉錄調控。得到脂肪細胞的分化的過程不僅與細胞內脂質積累有關，還與各種轉錄因子的調控有關，特別是Pparγ和C/ebpα被認為是分化過程中高表達的主調控因子。此外，它們還被認為是脂肪細胞中多種蛋白質的表達調節因子。與未處理組相比，APS1和APS2均有效降低了Pparγ、 C/ebpα和Fas的mRNA表達水平。（圖7）
總結
綜上所述，在APS1和APS2分子中分別鑒定出不同比例的的9種單糖類型。其中APS2的Ara和GalA含量高于APS1，APS1的摩爾質量比APS2大，但APS2的摩爾質量分布范圍更大。APS1和APS2均通過下調Pparγ、C/ebpα和Fas的mRNA表達水平，顯著抑制3T3-L1細胞的脂肪生成和脂質積累，而且APS2具有更強的抗成脂作用。因此，APS可能是一種對抗肥胖的藥物或功能性食品的潛在候選藥物，這些發現也為具有特定生物活性植物源性PS的靶向分離提供了一個科學的視角。
三黍多糖項目
