2021年11月，佛羅里達農工大學Protiva Rani Das團隊在Food Chemistry（IF 7.514）上發表了題為”Diversity in blueberry genotypes and developmental stages enables discrepancy in the bioactive compounds, metabolites, and cytotoxicity”的文章。通過8個藍莓品種在三個發育階段的總代謝物含量、抗氧化、抗癌活性和非靶向代謝物譜分析，為后續的研究提供了一個全面的藍莓生物活性代謝物和生物活性的類型、相對數量和積累模式的數據庫，對食品和保健品行業的發展具有指導意義。
以思維導讀形式呈現
1.1藍莓各階段總代謝產物含量及抗氧化活性
通過總酚含量(TPC)、總黃酮含量(TFC)、總花青素含量(TAC)、DPPH自由基清除活性和FRAP抗氧化活性的測定，得到各個階段藍莓的總代謝產物含量和抗氧化活性。
研究發現各生育期及各品種藍莓的代謝物及抗氧化活性差異較大，總體而言大多數品種在發育第一階段的TPC、TFC及TAC含量顯著高于第二和第三階段，但是他們的積累方式是不一樣的。通過DPPH和FRAP測定藍莓提取物的抗氧化潛力并結合TPC和TFC結果得知，不同品種和發育階段TPC和TFC的變化伴隨著抗氧化活性的差異。在研究的8個品種中，Vernon品種具有更高的TPC、TFC及TAC的水平。
圖1. 不同藍莓品種在不同發育階段的(A)表型、(B) 總酚含量 (TPC)、(C) 總黃酮含量 (TFC)、(D) 總花青素含量 (TAC)、(E) DPPH 自由基清除活性和 (F) FRAP 活性研究
1.2藍莓提取物對癌細胞生長的抑制作用
測定了不同品種和不同發育階段的藍莓不同濃度的提取物對癌細胞活性的影響(表1).結果表明藍莓提取物的抗癌活性與劑量和孵育時間有關，并且提取物在250 ~ 500 ng/mL范圍對三種細胞的生長均有顯著的抑制效果。
選取了抗癌活性最高的Vernon和最低的Star藍莓品種，進一步研究了藍莓提取物的潛在抗癌活性。結果表明，Vernon在發育階段I中抗癌活性最強，這可能與其具有較高的生物活性代謝物含量有關。（圖2）
圖2. (A)選定的藍莓品種在不同發育階段，在500 ng/mL劑量下孵育48 h，對A549、HepG2和Caco-2癌細胞生長的抑制率(%)。(B)選定的藍莓品種在整個發育階段對(B) A549， (C) HepG2和(D) Caco-2癌細胞48小時的IC50值。
1.3非靶代謝分析
選取具代表性的品種Vernon和Star進行代謝組學分析（圖3）。共檢測出328種代謝物，基于代謝物集富集分析(MSEA)分析可知，P值較高的主要化學基團為氨基酸和多肽、脂肪酸和共軛物、三羧酸、有機羧酸等。
通過PCA圖分析可知相較于發育的階段差異，品種間的差異主要影響了藍莓代謝產物的差異（圖4）。火山圖結果可知在Vernon的每個發育階段這三種常見代謝物epiafzelechin 3-gallate、lucuminic acid和naringin都顯著上調。相比之下，各階段下調的代謝產物如沒食子酸、曲酸、2,5-呋喃二甲酸、5-羥基-2-糠酸等物質較為常見（圖4）。
圖3.代謝物集富集分析(MSEA)圖
圖4. PCA和柱形圖分析（展示火山圖前20種 FC 代謝物模式）
1.4生物標志物代謝物的篩選及其與抗癌活性的相關性
對Vernon和Star的328個已鑒定的藍莓代謝物進行 PLS-DA分析，根據不同的重要度(VIP>1)評分獲得17個生物標志物代謝物，包括其中奎寧酸、甲基琥珀酸、檸檬酸、草酸、蘋果酸、氧戊二酸、賴氨酸等。
進一步對鑒定得到的生物標志物化合物和抗癌活性進行熱圖分析，結果表明藍莓代謝產物的相對含量和抗癌性在不同品種間存在明顯的差異。與Star相比，Vernon品種具有更高的抗癌活性，這可能是因其所鑒定的生物標志物含量更高（圖5）。通過對 17 種生物標志物的抗癌活性進行了相關性分析，結果篩選出綠原酸、氧代己二酸、奎尼酸、甲基琥珀酸和蘋果酸這5種具有較高抗癌潛力的代謝物，與此同時， Vernon品種在每個發育階段包含的每種生物標志物的相對含量顯著較高（圖6）。
圖5. PLS-DA分析圖以及抗癌活性的熱圖VIP (≥1.0)
圖6. 生物標志物的篩選及相關性分析
作者對不同品種不同發育階段的藍莓果實進行了總代謝物、抗氧化活性、抗癌潛力和非靶代謝組研究，發現品種差異是導致藍莓提取物之間差異的主要原因。多元統計分析確定了五種與抗癌活性呈較高正相關的生物標志物包括奎尼酸、甲基琥珀酸、綠原酸、氧代己二酸和蘋果酸。且證實，相對于其他階段，發育階段 I（未成熟）的藍莓果實含有更高的酚類物質和類黃酮含量以及更高的抗氧化和抗癌活性。本研究中鑒定的生物標志物及其證明的抗癌活性預計對食品、制藥、營養保健品等領域具有重要價值，對開發具有抗癌潛力的新藍莓種質具有深遠影響。
