2021年11月，佛羅里達(dá)農(nóng)工大學(xué)Protiva Rani Das團(tuán)隊(duì)在Food Chemistry（IF 7.514）上發(fā)表了題為”Diversity in blueberry genotypes and developmental stages enables discrepancy in the bioactive compounds, metabolites, and cytotoxicity”的文章。通過(guò)8個(gè)藍(lán)莓品種在三個(gè)發(fā)育階段的總代謝物含量、抗氧化、抗癌活性和非靶向代謝物譜分析，為后續(xù)的研究提供了一個(gè)全面的藍(lán)莓生物活性代謝物和生物活性的類(lèi)型、相對(duì)數(shù)量和積累模式的數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)食品和保健品行業(yè)的發(fā)展具有指導(dǎo)意義。
以思維導(dǎo)讀形式呈現(xiàn)
1.1藍(lán)莓各階段總代謝產(chǎn)物含量及抗氧化活性
通過(guò)總酚含量(TPC)、總黃酮含量(TFC)、總花青素含量(TAC)、DPPH自由基清除活性和FRAP抗氧化活性的測(cè)定，得到各個(gè)階段藍(lán)莓的總代謝產(chǎn)物含量和抗氧化活性。
研究發(fā)現(xiàn)各生育期及各品種藍(lán)莓的代謝物及抗氧化活性差異較大，總體而言大多數(shù)品種在發(fā)育第一階段的TPC、TFC及TAC含量顯著高于第二和第三階段，但是他們的積累方式是不一樣的。通過(guò)DPPH和FRAP測(cè)定藍(lán)莓提取物的抗氧化潛力并結(jié)合TPC和TFC結(jié)果得知，不同品種和發(fā)育階段TPC和TFC的變化伴隨著抗氧化活性的差異。在研究的8個(gè)品種中，Vernon品種具有更高的TPC、TFC及TAC的水平。
圖1. 不同藍(lán)莓品種在不同發(fā)育階段的(A)表型、(B) 總酚含量 (TPC)、(C) 總黃酮含量 (TFC)、(D) 總花青素含量 (TAC)、(E) DPPH 自由基清除活性和 (F) FRAP 活性研究
1.2藍(lán)莓提取物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用
測(cè)定了不同品種和不同發(fā)育階段的藍(lán)莓不同濃度的提取物對(duì)癌細(xì)胞活性的影響(表1).結(jié)果表明藍(lán)莓提取物的抗癌活性與劑量和孵育時(shí)間有關(guān)，并且提取物在250 ~ 500 ng/mL范圍對(duì)三種細(xì)胞的生長(zhǎng)均有顯著的抑制效果。
選取了抗癌活性最高的Vernon和最低的Star藍(lán)莓品種，進(jìn)一步研究了藍(lán)莓提取物的潛在抗癌活性。結(jié)果表明，Vernon在發(fā)育階段I中抗癌活性最強(qiáng)，這可能與其具有較高的生物活性代謝物含量有關(guān)。（圖2）
圖2. (A)選定的藍(lán)莓品種在不同發(fā)育階段，在500 ng/mL劑量下孵育48 h，對(duì)A549、HepG2和Caco-2癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率(%)。(B)選定的藍(lán)莓品種在整個(gè)發(fā)育階段對(duì)(B) A549， (C) HepG2和(D) Caco-2癌細(xì)胞48小時(shí)的IC50值。
1.3非靶代謝分析
選取具代表性的品種Vernon和Star進(jìn)行代謝組學(xué)分析（圖3）。共檢測(cè)出328種代謝物，基于代謝物集富集分析(MSEA)分析可知，P值較高的主要化學(xué)基團(tuán)為氨基酸和多肽、脂肪酸和共軛物、三羧酸、有機(jī)羧酸等。
通過(guò)PCA圖分析可知相較于發(fā)育的階段差異，品種間的差異主要影響了藍(lán)莓代謝產(chǎn)物的差異（圖4）。火山圖結(jié)果可知在Vernon的每個(gè)發(fā)育階段這三種常見(jiàn)代謝物epiafzelechin 3-gallate、lucuminic acid和naringin都顯著上調(diào)。相比之下，各階段下調(diào)的代謝產(chǎn)物如沒(méi)食子酸、曲酸、2,5-呋喃二甲酸、5-羥基-2-糠酸等物質(zhì)較為常見(jiàn)（圖4）。
圖3.代謝物集富集分析(MSEA)圖
圖4. PCA和柱形圖分析（展示火山圖前20種 FC 代謝物模式）
1.4生物標(biāo)志物代謝物的篩選及其與抗癌活性的相關(guān)性
對(duì)Vernon和Star的328個(gè)已鑒定的藍(lán)莓代謝物進(jìn)行 PLS-DA分析，根據(jù)不同的重要度(VIP>1)評(píng)分獲得17個(gè)生物標(biāo)志物代謝物，包括其中奎寧酸、甲基琥珀酸、檸檬酸、草酸、蘋(píng)果酸、氧戊二酸、賴氨酸等。
進(jìn)一步對(duì)鑒定得到的生物標(biāo)志物化合物和抗癌活性進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果表明藍(lán)莓代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量和抗癌性在不同品種間存在明顯的差異。與Star相比，Vernon品種具有更高的抗癌活性，這可能是因其所鑒定的生物標(biāo)志物含量更高（圖5）。通過(guò)對(duì) 17 種生物標(biāo)志物的抗癌活性進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果篩選出綠原酸、氧代己二酸、奎尼酸、甲基琥珀酸和蘋(píng)果酸這5種具有較高抗癌潛力的代謝物，與此同時(shí)， Vernon品種在每個(gè)發(fā)育階段包含的每種生物標(biāo)志物的相對(duì)含量顯著較高（圖6）。
圖5. PLS-DA分析圖以及抗癌活性的熱圖VIP (≥1.0)
圖6. 生物標(biāo)志物的篩選及相關(guān)性分析
作者對(duì)不同品種不同發(fā)育階段的藍(lán)莓果實(shí)進(jìn)行了總代謝物、抗氧化活性、抗癌潛力和非靶代謝組研究，發(fā)現(xiàn)品種差異是導(dǎo)致藍(lán)莓提取物之間差異的主要原因。多元統(tǒng)計(jì)分析確定了五種與抗癌活性呈較高正相關(guān)的生物標(biāo)志物包括奎尼酸、甲基琥珀酸、綠原酸、氧代己二酸和蘋(píng)果酸。且證實(shí)，相對(duì)于其他階段，發(fā)育階段 I（未成熟）的藍(lán)莓果實(shí)含有更高的酚類(lèi)物質(zhì)和類(lèi)黃酮含量以及更高的抗氧化和抗癌活性。本研究中鑒定的生物標(biāo)志物及其證明的抗癌活性預(yù)計(jì)對(duì)食品、制藥、營(yíng)養(yǎng)保健品等領(lǐng)域具有重要價(jià)值，對(duì)開(kāi)發(fā)具有抗癌潛力的新藍(lán)莓種質(zhì)具有深遠(yuǎn)影響。
