鮮發酵米粉(FFRN)是亞洲國家一種重要的主食。傳統的FFRN的生產主要依賴于大米原料和周圍環境的微生物，發酵周期長，品控不穩定，且存在一定的安全隱患。已經有研究商業用的發酵劑，但是發酵劑的組成并沒有統一的規定。經研究發現，發酵大米漿不同發酵階段的優勢菌為發酵硅乳桿菌，而作為發酵系統中的優勢酵母，釀酒酵母菌不但可以分泌胞外酶，而且在發酵過程中可以產生CO2使得面團蓬松且產生各種風味化合物，同時它的成本較為低廉。而發酵乳桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母菌重組發酵劑用于FFRN的研究鮮有報道。
2022年3月22日，中國農業科學院食品科學技術研究所王鳳忠課題組在Food Research International（IF=6.475））雜志上在線發表了題為“Edible qualities, microbial compositions and volatile compounds in fresh fermented rice noodles fermented with different starter cultures”的研究論文。作者通過HS-SPME-GC-MS、HS-GC-IMS和高通量DNA測序技術比較了四種添加發酵劑以及自然發酵的FFRN的蒸煮品質、質地以及微生物組成和揮發性化合物。該項研究在提高了工業生產效率的同時也確保了FFRN的食用安全。
研 究 材 料
植物乳桿菌(L.p)
植物乳桿菌+發酵乳桿菌，命名為(l.f)
植物乳桿菌+釀酒酵母菌(L.p + S.c)
植物乳桿菌+發酵乳桿菌+釀酒酵母菌(l.f f + S.c)
自然發酵（NF）
研 究 結 果
1.1 PH值的變化
研究發現，隨著時間的延長，PH均有所降低，且NF組的最高。并且加了乳酸桿菌的PH降低更快，這可能與發酵過程中乳酸桿菌代謝為了乳酸所致。
圖1 PH值的變化
1.2 FFRN的烹飪品質和結構特征
與NF組相比，添加發酵劑的4組蒸煮損失和蒸煮水濁度均較低，其中L.pf + S.c組最低。結果表明，發酵劑發酵破壞了淀粉的有序晶體結構，降解了蛋白質和脂質，蛋白質網絡對淀粉顆粒的約束會減弱，從而導致淀粉凝膠結構的強化。因此，FFRN的硬度、回彈性、彈性和咀嚼性均有增加的趨勢。
表1 五種發酵米粉的蒸煮特性及質構分析(TPA)。
1.3 FFRN微生物學分析
1.3.1 不同FFRN中alpha多樣性的變化
經篩選和優化后，15份樣本獲得了237條細菌OTUs以及692條真菌OTUs. 除NF組外，其他各組Sobs指數均在0 h時最高，與Shannon和Chao指數的變化趨勢一致。這說明細菌種類在早期最為豐富，一些原始細菌可能來自水稻或加工環境。這就是為什么自然發酵不能保證FFRN的安全性的原因。NF組的Sobs、Shannon和Chao指數在第一個發酵階段呈下降趨勢，在第二個發酵階段略有上升，且均高于其他4個添加發酵劑組, 真菌群落豐富度隨著時間的延長而降低.
圖2 鮮發酵米粉不同發酵階段微生物α多樣性研究
1.3.2 FFRN中的微生物群落
發酵過程中FFRN的微生物組成和多樣性變化如圖3所示。細菌在門水平的相對豐度如A所示，檢測到3個細菌門，包括厚壁菌門、藍藻菌門和變形菌門。在整個發酵過程中，相較于NF組而言，其余四組的厚壁菌門所占百分比顯著提高。B圖中展示的是檢出的9個屬，發酵過程表明，高酸環境可以抑制發酵過程中細菌的生長。而NF組的結果表明，他的細菌組成受環境影響較大，并且其組成多樣不可控。因此，添加了乳酸菌的FFRN安全性更佳。
圖3 鮮發酵米粉細菌組成的變化
1.3.3 FFRN發酵的異同
韋恩圖反應了不同發酵劑培養的FFRN屬水平的微生物組成（圖4）。共鑒定出43種細菌和78種真菌，其中9種細菌和32種真菌在整個發酵過程中被發現，并且發酵劑的組成在每個組都是獨一無二的。通過LDA效應分析可知，自然發酵過程受環境影響較大，其產物中的細菌群落具有多樣性和不可控性。
圖4 發酵過程中微生物組成的變化及差異分析
1.4 FFRN的風味組學
1.4.1 HS-GC-IMS圖譜隨發酵時間的變化
采用HS-GC-IMS法對不同發酵劑發酵不同時期FFRN中揮發性成分進行分析。所有樣品揮發性成分的三維(3D)地形圖如圖5A-C所示，其中添加了發酵劑的峰形相似。為了方便觀察，取俯瞰圖進行進一步比較（圖5D-F），0 h時大部分信號出現在停留時間范圍100 ~ 800 s之間，漂移時間為1.0 ~ 2.0，而FFRNs在發酵末期的停留時間迅速增加到1200 s。這一結果表明，揮發性物質大量存在。極性化合物在非極性柱上的保留最少，因此它們的保留時間集中在100-200 s。由此可見，在發酵劑中添加釀酒酵母可能有助于極性化合物的形成或減少非極性化合物的種類。
圖5 新鮮發酵米粉HS-GC-IMS的地形圖(A、B、C)，
地形圖(D、E、F)和定性分析地形圖(G、H、I)的俯視圖
1.4.2不同發酵時間FFRN中揮發性成分的變化
采用長廊圖法對不同發酵劑發酵的FFRN揮發物進行指紋圖譜分析（表2）。共測量了55種揮發性化合物，包括7種醇、17種醛、8種酮、1種酸、8種酯和11種未識別的化合物。醛是影響發酵大米產品風味的主要化合物。酒精對發酵米粉獨特的風味形成起著重要的作用，他可以促進乙醇的產生. 同樣，5種FFRN產物中酮的比例也不同，這與發酵劑微生物組成和代謝產物的差異有關。醇類和酯類是發酵產品散發出愉悅風味的重要化合物，如發酵米酒和干發酵香腸。這些結果表明，發酵劑的微生物代謝有利于酯的形成。
表2 GC-IMS法測定了新鮮發酵米粉中42種化合物的相對含量
1.4.3 HS-SPME-GC-MS分析不同發酵時間FFRNs中揮發性組分的變化
采用HS-SPME-GC-MS對發酵0 h和6 h的揮發性成分進行檢測，綜合了解FFRNs揮發性成分隨發酵時間的變化. 與HS-GC-IMS結果相似，隨著發酵，大部分揮發性化合物的種類和比例增加，說明添加發酵劑有利于揮發性化合物的形成（表3）。大米制品中主要的風味物質是醛類物質，其閾值一般較低，在低濃度下可以提供草香或果香，但在高濃度下風味較差。
表3 氣相色譜-質譜法測定新鮮發酵
米粉中揮發性化合物的相對氣味活性值
1.4.4基于PLS-DA的揮發性化合物相似性分析
利用SIMCA軟件對5種不同階段的揮發性化合物進行相似性和差異性分析，根據數據矩陣進行PLS-DA監督方法。該模型的這些結果與GC-IMS五組聚類一開始的結果相似（圖6）。這一發現進一步證實了發酵后FFRNs的揮發性譜發生了顯著變化，添加菌株懸浮液會深刻影響其揮發性譜。
圖6 新鮮發酵米粉發酵過程中揮發性
物質的偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)
1.5 FFRN中主要揮發性成分與風味特征的相關性研究
為了進一步分析揮發性化合物對FFRN風味的貢獻，通過GC-IMS和GC-MS儀器獲得了rOAV。化合物的rOAV大于1表明這些化合物對風味有重要貢獻，rOAV在1到0.1之間的成分被認為對整體風味有作用。FFRN中的大部分揮發性化合物具有相似的香氣特征，如大部分的果香、蔬菜香、花香和草香。值得注意的是，大多數揮發性化合物的rROAV在含釀酒酵母菌組別中更高，這表明這些組分的風味更足。綜合風味、微生物組成和品質等因素，以L.pf + S.c組為最佳選擇。如前所述，添加L.pf + S.c制備的FFRN具有理想的風味和優良的品質。
小 結
本研究表明，與自然發酵相比，添加發酵劑可縮短發酵時間，且添加發酵劑的FFRNs的質地和蒸煮品質優于NF組，尤其是L.p + S.c和l.f + S.c組。此外，發酵劑中發酵菌、植物乳桿菌和釀酒酵母菌在發酵過程中占主導地位，提供了穩定的微生物組成，保證了FFRN的安全性，有利于產生多種揮發性化合物。風味組學共鑒定出115種揮發性化合物，其中HS-GC-IMS鑒定55種，HS-SPME-GC-MS鑒定60種。添加發酵劑基團中的醇、酸、酯和酮大部分在發酵過程中積累，醛隨著發酵時間的延長而減少。其中，50種揮發性化合物的rOAV大于0.1，對FFRN的特征風味形成有較大貢獻。特別是添加了釀酒酵母組的風味比只添加了乳酸菌的組的風味更豐富。此外，PLS-DA模型表明，不同發酵劑發酵的5種ffnn的揮發性化合物分布占據相對獨立的空間，易于區分。綜上所述，L.p + S.c組和L.pf + S.c組的FFRN風味更豐富、微生物組成更穩定、品質更優，其中L.pf + S.c組的FFRN綜合品質最好。本研究為今后進一步研究FFRN產品的發酵劑奠定了基礎。小 結
