茶作為一種非酒精飲料，含有豐富的次生代謝物，其中黃酮苷約占新鮮茶葉中茶多酚總量的13%，它具有許多顯著的健康益處，如抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。類黃酮苷是典型的苦味和澀味化合物，有助于茶飲料的味道。然而，在茶樹中促進苦味化合物（如黃酮類化合物7-O-新橙皮糖苷）生物合成的基因尚未確定。2022年2月Journal of Agricultural and Food Chemistry在線一篇題為“Two UDP-Glycosyltransferases Catalyze the Biosynthesis of Bitter Flavonoid 7-O-Neohesperidoside through Sequential Glycosylation in Tea Plants” 的研究論文。該研究確定兩種UDP糖基轉(zhuǎn)移酶（類黃酮7-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和7-O-葡萄糖苷-1,2-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶）通過糖基化催化類黃酮7-O-新橙皮糖苷的生物合成，該研究為控制茶的苦味和澀味提供了關鍵的分子標記。

02

材料方法

植物材料和標準品

基因組的序列分析和克隆

rCsUGTs的異源表達與純化

酶法測定rCsRHMb和RCSUGT

代謝物提取

LC-MS/MS分析

基因表達分析

亞細胞定位

03

研究路線

04

研究結(jié)果

1. C. sinensis.中CsUGTs的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

研究搜索茶樹中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)確定了178個CsUGT基因，對其轉(zhuǎn)錄水平的分層聚類分析表明，這些基因分為四種表達模式（圖2），在不同的組織中發(fā)揮糖基化功能。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，CsUGT79B28可能具有分支形成糖基轉(zhuǎn)移酶活性，并催化以單糖為底物的糖基化第二步生成類黃酮二糖苷。

圖2 不同組織UGT基因轉(zhuǎn)錄層次聚類分析

圖3 參與類黃酮二糖苷生物合成候選基因CsUGT的系統(tǒng)發(fā)育分析。

2. CsRHMb和CsUGT75L12的酶學特性

使用MBP標簽純化系統(tǒng)純化重組CsRHMb（rCsRHMb）和CsUGT75L12（rCsUGT75L12）蛋白。酶分析結(jié)果表明，CsRHMb在體外選擇性催化UDP-glc轉(zhuǎn)化為UDP-rah（圖4B）。分別使用黃酮類化合物和UDP-glc作為糖受體和供體對rCsUGT75L12蛋白進行初始酶活性測定，分析表明，rCsUGT75L12對以UDP-glc為糖供體的七種黃酮類化合物均具有活性，在黃酮類化合物的7-OH位置上具有葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性，并對糖受體表現(xiàn)出廣泛的底物特異性，產(chǎn)生相應的類黃酮7-O-葡萄糖苷。

圖4 CsRHMb、CsUGT75L12和CsUGT79B28的生化特性

3. CsUGT79B28催化類黃酮7-O-二糖苷生物合成

為了確定CsUGT79B28是否負責鼠李糖基化的第二步，該步驟涉及將類黃酮單糖苷轉(zhuǎn)化為類黃酮7-O-二糖苷，體外分別以UDP-rha和類黃酮7-O-糖苷作為糖供體和受體，酶分析rCsUGT79B28蛋白，結(jié)果表明，rCsUGT79B28特異性催化類黃酮7-O-葡萄糖苷的C-2′位置，從而產(chǎn)生類黃酮7-O-新橙皮苷。

圖5  不同底物下重組CsUGT75L12和CsUGT79B28蛋白的活性篩選

4. 重組酶的生化特性

為了表征兩種蛋白質(zhì)rCsUGT75L12和rCsUGT79B28的酶學性質(zhì)，通過測量相對酶活性來確定最佳反應pH和溫度。結(jié)果表明，在茶樹中，rCsUGT75L12和rCsUGT79B28蛋白都可能在不同的pH條件下進行糖基化，CsUGT75L12和CsUGT79B28催化黃酮類化合物的順序糖基化和鼠李糖基化，產(chǎn)生類黃酮7-O-新橙皮苷。

圖6 rCsUGT75L12和rCsUGT79B28反應條件的優(yōu)化

5. CsUGTs的基因表達及黃酮苷的代謝產(chǎn)物譜

研究通過質(zhì)譜確定了化合物柚皮素7-O-葡萄糖苷和柚皮素7-O-新橙皮苷化合物（圖7A）。qRT-PCR和LC-MS/MS分析，分別測定了茶樹不同組織中的代謝物，以及柚皮素7-O-葡萄糖苷和柚皮素7-O-新橙皮苷的表達水平和積累模式，結(jié)果表明CsUGT75L12和CsUGT79B28表現(xiàn)出相似的表達譜，并在不同茶組織中高度表達（圖7B）。對三種基因CsUGT75L12、CsUGT79B28和CsRhMb瞬時表達的研究，三種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出相似的表達譜，位于葉細胞的細胞質(zhì)和細胞核中（圖7D）。

圖7 CsUGTs的基因表達和類黃酮苷的代謝產(chǎn)物譜

05

小結(jié)

該研究確認了兩種化合物通過黃酮類化合物的連續(xù)糖基化和鼠李糖基化參與黃烷酮7-O-新橙皮苷的生物合成。該發(fā)現(xiàn)不僅為茶樹類黃酮二糖苷代謝提供了分子見解，而且為控制茶的苦味和澀味提供了關鍵的分子標記。

三黍產(chǎn)品