植物領域的機制研究正從單一維度向系統化整合邁進，其中“激素檢測+多組學+功能驗證”的設計思路因其多層次解析能力，正逐步成為高分研究的核心策略。

植物激素檢測通過高靈敏度質譜技術追蹤植物激素代謝的時空變化，為信號網絡提供定量基礎；在此基礎上整合其他多組學數據（轉錄組、蛋白組）則能全局性捕捉基因表達、蛋白互作與代謝重編程的協同模式，從海量數據中篩選關鍵調控節點。進一步拓展的功能驗證環節，基因編輯、分子互作（如CO-IP、雙熒光素酶系統）等實驗，則能夠在遺傳與生化層面確證靶點功能，建立“激素-基因-表型”的完整假說驗證，為文章的完成度再提高一個檔次。這一設計思路突破傳統單一技術的局限，其系統性、可驗證性高度契合頂級期刊對創新性與完整性的要求，已成為揭示新機制、發表高分文章的有效路徑。

研究對象：水稻

技術方法：植物激素含量檢測、基因編輯、qRT-PCR、miRNA Northern blot、CO-IP、BiFC、Y2H、Dual-LUC等

1.生長素信號激活水稻對褐飛虱的抗性

為了評估生長素在水稻抗褐飛虱中的作用，在褐飛虱處理之前用生長素類似物萘乙酸（NAA）處理水稻幼苗。7至10天后，所有未經NAA處理的植物死亡，0.1μM NAA處理的植株仍然存活，而用1μM NAA治療的大多數植株也死亡了（圖1A），存活率表明低濃度NAA激活了BPH抗性（圖1B），但當NAA濃度升高時，促進作用下降（圖1C），因此存活率較低（圖1D），證實較高濃度NAA處理抑制了水稻植物的褐飛虱抗性。同時，使用抗褐飛虱水稻品種“Rathu Heenati”（RHT）和褐飛虱易感品種“9311”植株，測量了褐飛虱侵染后內源IAA含量。在這兩個品種中，IAA含量在BPH侵染后12和24小時下降，RHT的下降幅度大于9311（圖1，E和F）。因此，BPH侵染降低了寄主植物中的IAA含量。

圖1 生長素與水稻褐飛虱侵染的關系

兩種主要的水稻生長素受體編碼基因OsTIR1和OsAFB2的表達受BPH侵染誘導，所以構建了OsTIR1和OsAFB2過表達的轉基因植物（分別為TIR1OE和AFB2OE）（圖2，A和B）和編輯的植物（分別是TIR1KO和AFB2KO）。TIROE-1植物的死亡時間都晚于野生型（WT）植物（圖2E和F），并且TIROE-1植物在BPH侵染后的存活率遠高于WT（圖2G）。同樣，TIROE-2植物比WT植物死亡晚（圖2，H和I），總體存活率更高（圖2J）。相比之下，TIR1KO-1（圖2，K和L）和TIR1KO-2植物（圖2中，K和N）比野生型植物更早死亡，各自的存活率遠低于野生型（圖2中的M和O）。AFB2KO-1（圖2，P和Q）和AFB2KO-2植株（圖2、P和S）比野生型植株早死亡，兩個品系的存活率都比野生型低得多（圖2：R和T）。因此，生長素激活BPH抗性可能是由OsTIR1和OsAFB2受體介導的。

圖2 TIR1OE、TIR1KO、AFB2OE和AFB2KO植物的褐飛虱抗性

2.OsmiR393對生長素信號傳導進行轉錄后調控，并對BPH抗性產生負面影響

為了研究OsmiR393在BPH抗性中的作用，在“日本晴”（NIP）遺傳背景下構建了OsMIR393a和OsMIR393b過表達和敲除植物，并進行了驗證（圖3）。

在個體和小群體試驗中，OsmiR393過表達的植物都比野生型植物死亡得早得多（圖4A至I），表明其易患BPH。OsmiR393雙敲除植物植株比野生型植株晚死亡，表明對褐飛虱的抗性增強（圖4J至O），因此，OsmiR393a和OsmiR393b雙敲除植物對褐飛虱的抗性增強。

與NIP植物相比，以393bOE植物為食的BPH個體排泄的蜜露量要高得多，而以393DKO-1植物為食料的BPH排泄的蜜露量則大大減少（圖4P）。綜上所述，這些結果表明生長素信號通路受OsmiR393的轉錄后調控，OsmiR393負調控水稻對褐飛虱的抗性。

圖3 393aOE、393bOE和393DKO的驗證和檢測

圖4 393aOE、393bOE和393DKO植株與野生型植株的褐飛虱抗性比較

3.OsIAA10與OsTIR1相互作用介導BPH抗性

酵母雙雜交（Y2H）試驗發現許多OsIAA在酵母系統中與OsTIR1-相互作用（圖S2）。進一步實驗證明OsIAA2、OsIAA7、OsIAA10、OsIAA16和OsIAA24基因在393DKO-1植株中下調，但在393bOE植株中上調（圖5A）。響應性表達分析顯示，這些基因對BPH感染敏感，OsIAA10表現出最強的誘導反應（圖5B）。在個體試驗和小群體試驗中，IAA10KO-1和IAA10KO-2植株（12株）比“中華11號”（ZH11）野生型植株晚死亡（圖5，C，D和F），其各自的存活率高于小群體試驗（圖5、E和G）中的野生型植株。IAA10OE-1和IAA10OE-2植物比野生型植物更早死亡（圖5，H、I和K），它們各自的存活率低于小群體試驗的野生型（圖5、J和L）。因此，OsIAA10負調控BPH抗性。

圖5 OsIAA基因的表達及OsIAA10的遺傳功能分析

4.OsARF12在OsTIR1/OsIAA10的下游介導BPH抗性

在Y2H測定中，攜帶OsIAA10和OsARF12的酵母在SD/-T-L-H-A培養基上生長良好（圖6A）。此外，OsIAA10和OsARF12之間的相互作用在LCI（圖6B）、BiFC（圖6C）和共免疫沉淀（co-IP）檢測中得到了驗證（圖6D）。所有這些生化分析表明，OsIAA10在體外和體內與OsARF12相互作用。因此，OsTIR1/OsIAA10模塊可能通過OsARF12發揮作用，介導下游生長素信號傳導。

在個體和小群體試驗的測試中，ARF12過表達和敲除植株的死亡時間和存活率統計以及BPH個體排泄的蜜露量統計結果表明，OsARF12正向調節BPH抗性（圖6E-P）。在單獨測試中，雜交植物393DKOk/ARF12KOk比393DKOk植物更容易感染BPH，其狀態與野生型植物相似（圖6Q）。因此，393DKOk植株的褐飛虱抗性依賴于OsARF12基因。

圖6 OsIAA10和OsARF12的相互作用驗證以及OsARF12的遺傳功能分析

5.OsARF12基因激活下游基因OsRbohB

BPH感染嚴重影響了七個基因的表達，其中OsRbohB的誘導是最明顯的變化（圖7A）。利用OsRbohB突變體的BPH抗性來研究OsRbohB在BPH抗性中的作用。在BPH侵染之前，osrbohB突變體中的H₂O₂含量低于NIP，如3,3′-二氨基聯苯胺（DAB）染色和H₂O₂含量測量所示（圖7，B和C）。BPH侵染激活了osrbohB突變體和NIP植物中H₂O₂的積累，但osrbohB突變體植物中的激活程度與NIP植物不可比（圖7，B和D）。因此，OsRbohB基因通過H2O2的積累正向調節BPH抗性。

利用GAL4系統檢測OsARF12的轉錄激活效果，將OsARF12的全長編碼序列與GAL4BD融合，并在35S啟動子的控制下進行表達。結果顯示，GAL4BD-ARF12的熒光素酶活性明顯高于負對照，表明OsARF12具有轉錄激活功能。接著，通過表達分析發現ARF12過表達（ARF12OE）的植物中OsRbohB基因上調，而在ARF12缺失（ARF12KO）的植物中則下調，提示OsARF12可能調控OsRbohB。此外，在393DKO（雙基因缺失）植物中OsRbohB上調，而在393aOE和393bOE植物中下調，表明OsRbohB可能參與OsmiR393介導的信號通路。還確認了OsARF12能夠結合OsRbohB啟動子的DNA結合位點，并且能夠激活其表達。

為了進一步驗證OsRbohB基因在OsmiR393/OsTIR1-OsIAA10-OsARF12通路中介導BPH抗性的作用，在ARF12KO-1背景中過表達OsRbohB，發現這些轉基因植物對BPH的抗性得以恢復。此外，通過對393DKO-1植物進行OsRbohB敲除實驗，結果顯示393DKO-1/RbohBKO植物對BPH更加敏感，表明393DKO-1植物的抗性依賴于OsRbohB基因。

總結來說，研究表明OsARF12直接激活OsRbohB基因的表達，進而在OsmiR393/OsTIR1-OsIAA10-OsARF12信號通路中發揮作用，增強水稻對BPH的抗性。

圖7 OsARF12對OsRbohB的轉錄調控，OsRbohB的遺傳功能分析，及其與OsARF12和OsmiR393的遺傳關系

6.ROS參與OsmiR393/OsTIR1信號介導的BPH耐藥性

首先，研究表明ROS在植物防御反應的下游信號機制中發揮廣泛作用。為了驗證ROS是否在BPH抗性中起重要作用，首先用H₂O₂處理水稻植物，發現經過處理的植物在BPH侵染后存活率顯著提高，且濃度越高，存活率越高。接著，測量了不同水稻品種中H₂O₂的含量，發現抗性品種RHT的基礎H₂O₂含量高于易感品種9311，且在BPH侵染后，RHT的H₂O₂含量大幅上升，而9311的上升幅度則相對較小。

此外，還測量了過表達OsmiR393和基因編輯植物的H₂O₂含量，發現393DKO-1植物的H₂O₂含量明顯高于NIP，而393bOE植物的基礎H₂O₂含量與NIP相似。BPH侵染后，所有檢測植物的H₂O₂含量均增加，393DKO-1植物的增加幅度顯著高于NIP，而393bOE植物的增加幅度低于NIP。另一方面，OsARF12過表達及基因編輯植物的H₂O₂含量也被測量，結果顯示ARF12OE植物的基礎H₂O₂含量高于ZH11，而ARF12KO植物則低于ZH11。在BPH侵染后，這些植物的H₂O₂含量均有所增加，ARF12OE植物的增加幅度高于ZH11。

接下來調查了幾種基因改造植物中幾丁質是否能誘導ROS的產生，發現轉換了OsmiR393/OsTIR1-OsIAA10-OsARF12信號通路的植物（如393DKO、TIR1OE、IAA10KO和ARF12OE）中，幾丁質誘導的ROS產生增強，而393aOE、393bOE、TIR1KO、IAA10OE和ARF12KO植物中則ROS產生受到抑制。這表明ROS激活與BPH抗性之間關系密切，并且這一激活與OsmiR393/OsTIR1-OsIAA10-OsARF12-OsRbohB信號通路緊密相關。

研究者還測試了BPH抗性與ROS之間的關聯，發現ARF12KO-1植物的BPH易感性可通過OsRbohB過表達得到補救，同時ARF12KO-1植物中低ROS水平得以恢復。此外，393DKO-1/RbohBKO植物對BPH的抗性較393DKO-1植物差，并且在393DKO-1/RbohBKO植物中，幾丁質誘導的ROS產生也表現出顯著下降。最后，研究證明OsmiR393在遺傳上調控OsARF12以介導BPH抗性，同時在393DKO/ARF12KO植物中，幾丁質誘導的ROS產生低于393DKO植物，進一步支持這一遺傳關聯。

總結而言，ROS在水稻對BPH的抗性中發揮關鍵作用，且通過OsmiR393、OsARF12和OsRbohB等基因間的相互作用，調控ROS的產生，從而增強植物的抗病能力。

圖8 OsmiR393/TIR1-OsIAA10-OsARF12-OsRbohB通路中的ROS含量對BPH感染的反應