2025年，國家自然科學(xué)基金委員會(huì)發(fā)布《破譯生命的糖質(zhì)密碼重大研究計(jì)劃》，將糖質(zhì)（glycan）研究提升至國家戰(zhàn)略高度。糖質(zhì)作為生命信息的重要載體，與疾病發(fā)生、免疫調(diào)控、生殖健康等密切相關(guān)，但其復(fù)雜結(jié)構(gòu)與功能映射關(guān)系仍是后基因組時(shí)代的科學(xué)前沿。
該計(jì)劃提出三大核心科學(xué)問題：開發(fā)糖質(zhì)解碼工具、解析功能編碼規(guī)律和發(fā)展疾病干預(yù)策略，并重點(diǎn)支持糖質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、原位編輯技術(shù)、AI解析等方向。
如今，糖基化研究已從單一分子分析邁向多組學(xué)整合與精準(zhǔn)調(diào)控時(shí)代，為疾病診療、藥物開發(fā)提供全新視角。
作為一個(gè)大有潛力的研究熱點(diǎn)，我們應(yīng)當(dāng)如何設(shè)計(jì)、開展一個(gè)糖蛋白研究課題？
卵巢衰老通常先于其他器官衰退類型，但其分子機(jī)制尚不明確。
2025年4月發(fā)表在Redox Biology上的題為“A high-resolution N-glycoproteome landscape of aging mouse ovary”的文章中，作者通過蛋白組和N-糖基化修飾蛋白組，首次報(bào)道了糖基化在該過程中的獨(dú)特作用，并發(fā)現(xiàn)老年鼠卵巢中的糖基化蛋白種類和數(shù)量均降低，修飾類型也發(fā)生改變等，這些結(jié)構(gòu)改變可能導(dǎo)致了卵巢微環(huán)境的改變，并影響了卵巢老化過程，這為卵巢功能保護(hù)與延緩衰老提供了潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。
研究對象：小鼠（n=15）
技術(shù)方法：蛋白組，糖基化蛋白組，磷酸化蛋白組
研究思路：
糖基化修飾的復(fù)雜性為醫(yī)學(xué)研究提供了多維切入點(diǎn)，結(jié)合文獻(xiàn)與基金指南，以下選題方向可以參考：
腫瘤免疫調(diào)控：解析腫瘤微環(huán)境中糖質(zhì)修飾如何影響免疫細(xì)胞識別與耐受（如PD-L1糖基化修飾與免疫逃逸）。
生殖健康與衰老：卵巢透明帶糖鏈結(jié)構(gòu)與生育力關(guān)聯(lián)（如LacdiNAc糖鏈減少導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降）。
神經(jīng)退行性疾病：糖基化異常與阿爾茨海默癥中β-淀粉樣蛋白聚集的關(guān)系（如唾液酸化修飾調(diào)控炎癥通路）。
代謝性疾病：AGEs（晚期糖基化終末產(chǎn)物）在糖尿病并發(fā)癥中的作用及飲食干預(yù)策略。
1.衰老小鼠卵巢的蛋白組分析
作者首先收集了2月齡年輕小鼠和12月齡中年小鼠的卵巢組織各15份，分別代表20歲和45歲左右的人類女性。組織學(xué)結(jié)果顯示，中年卵巢中的不同發(fā)育階段卵泡減少，伴隨閉鎖卵泡顯著增多，且出現(xiàn)明顯的纖維化（圖1A-B）。隨后將每組樣本合并混合為5份，進(jìn)行糖蛋白組、磷酸化蛋白組和整體蛋白組的分析，最終鑒定出9033種蛋白和2270種N-糖蛋白及2590種磷酸化蛋白（圖1C-D）。
圖1 衰老小鼠卵巢的糖蛋白組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析
在做糖蛋白方向課題時(shí)，根據(jù)所研究的疾病類型，我們在采集樣本時(shí)也可以采取不同的策略。
腫瘤方向：對比癌組織與癌旁組織的糖蛋白組，篩選免疫檢查點(diǎn)糖基化標(biāo)志物。
神經(jīng)疾病：分析腦脊液外泌體糖蛋白，挖掘帕金森病早期診斷標(biāo)志物。
代謝疾病：研究糖尿病患者血清糖蛋白動(dòng)態(tài)變化，關(guān)聯(lián)血糖調(diào)控機(jī)制。
其他樣本建議：臨床組織（如腫瘤活檢）、體液（血液、腦脊液）、細(xì)胞模型（類器官/原代細(xì)胞）。
2.小鼠卵巢的糖蛋白景觀
作者鑒定到了3746個(gè)N-糖蛋白中的5857個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，在糖鏈水平過濾后，得到了858種N-糖鏈，3542個(gè)糖基位點(diǎn)和2270個(gè)N-糖蛋白（圖1E）。結(jié)果顯示，近一半的糖鏈有多個(gè)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，且蛋白上修飾最多的糖鏈為唾液酸化的雙分支結(jié)構(gòu)和寡甘露糖型（圖1F-G）。此外，盡管卵巢中主要糖鏈以雙分支和三分支為主，也檢測到了5-6分支的高分支糖鏈，通常攜帶唾液酸或巖藻糖，這在年齡增長中顯著下降，且與生育調(diào)控密切相關(guān)。
在N-糖結(jié)構(gòu)中，大多數(shù)糖基位點(diǎn)為復(fù)合聚糖，糖鏈中主要為唾液酸化、巖藻糖化或二者的聚糖修飾，核心結(jié)構(gòu)以N2H3和巖藻糖化為主，分支結(jié)構(gòu)以LacNAc和LacdiNAc終止結(jié)構(gòu)為主（圖1H-I）。
N-糖基化位點(diǎn)：
N-糖基化位點(diǎn)是指蛋白質(zhì)序列中特定的天冬酰胺（Asn-X-Ser/Thr）殘基，其糖鏈修飾可影響蛋白折疊、穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位及分子互作（如受體-配體識別）。其鑒定技術(shù)主要通過質(zhì)譜聯(lián)用酶切法（如PNGase F酶切釋放糖鏈）結(jié)合數(shù)據(jù)庫匹配（如UniProt糖基化位點(diǎn)注釋），實(shí)現(xiàn)高精度位點(diǎn)定位。
糖鏈異構(gòu)體：
糖鏈異構(gòu)體指同一糖基化位點(diǎn)上糖鏈分支結(jié)構(gòu)或修飾的差異，其生物學(xué)意義重大，如：
雙分支唾液酸化糖鏈（如Siaα2-6Galβ1-4GlcNAc）參與免疫調(diào)節(jié)，雙/三分支結(jié)構(gòu)（復(fù)合型）多見于成熟分泌蛋白，參與細(xì)胞黏附；
高分支結(jié)構(gòu)（5-6分支）可能通過空間位阻調(diào)控信號通路，與病原體逃逸或腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)；
寡甘露糖型（Man5-9GlcNAc2）常見于未成熟糖蛋白，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工狀態(tài)。
糖鏈的聚糖修飾：
糖鏈的聚糖修飾（如唾液酸化、巖藻糖化）可賦予蛋白新功能。核心結(jié)構(gòu)決定糖鏈加工方向，分支結(jié)構(gòu)影響分子識別，終止結(jié)構(gòu)（如硫酸化、唾液酸化）則決定最終生物活性。
| 三黍服務(wù) | 技術(shù)參數(shù) |
N-糖基化蛋白質(zhì)組學(xué) 完整糖肽分析 | |
N-糖基化蛋白質(zhì)組學(xué) 位點(diǎn)鑒定分析 | |
O-糖基化蛋白質(zhì)組學(xué) 完整糖肽分析 |
3.不同的亞細(xì)胞定位表現(xiàn)出多樣化的糖鏈結(jié)構(gòu)模式
根據(jù)UniprotKB數(shù)據(jù)庫的亞細(xì)胞定位注釋，糖蛋白主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架、高爾基體和溶酶體。卵膜區(qū)的糖蛋白呈現(xiàn)更高比例的復(fù)合糖鏈和核心巖藻糖化，分支結(jié)構(gòu)多樣，但唾液酸修飾少，與其他亞細(xì)胞區(qū)域區(qū)別明顯。在功能分析中，與卵膜結(jié)構(gòu)組成相關(guān)的糖蛋白所攜帶的糖鏈同樣以復(fù)合糖鏈和巖藻糖化結(jié)構(gòu)為主，在與生殖過程相關(guān)的糖蛋白中，LacdiNAc分支含量顯著升高，提示了該結(jié)構(gòu)的重要性（圖2）。
圖2 小鼠卵巢中糖蛋白不同亞細(xì)胞定位的聚糖結(jié)構(gòu)模式
糖基化修飾具有空間特異性，不同細(xì)胞器（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞膜）的糖鏈加工酶分布差異，導(dǎo)致糖蛋白功能分化。例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的寡甘露糖型糖蛋白可能參與蛋白折疊質(zhì)量控制，而細(xì)胞膜上的復(fù)合型糖鏈直接介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。
在醫(yī)學(xué)方向課題中，我們可通過以下步驟設(shè)計(jì)糖基化蛋白在亞細(xì)胞層面功能的驗(yàn)證：
定位注釋：
利用UniprotKB等數(shù)據(jù)庫獲取糖蛋白亞細(xì)胞分布（如分泌途徑、溶酶體），結(jié)合免疫熒光/電鏡驗(yàn)證。
功能關(guān)聯(lián)：
基因敲除/過表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶，觀察亞細(xì)胞定位變化及表型。
互作驗(yàn)證：
采用凝集素pull-down篩選結(jié)合受體，揭示糖鏈-功能軸。
4.Gly對肝胰腺蛋白表達(dá)的影響
在定量分析中，中年卵巢中有1556個(gè)上調(diào)糖肽，而下調(diào)糖肽有293個(gè)，其中，83%的差異糖肽來源于整體蛋白水平無顯著變化的糖蛋白，這表明與衰老相關(guān)的糖肽變化不是基于蛋白表達(dá)，而是位點(diǎn)特異性糖基化修飾導(dǎo)致的（圖3A-F）。在隨后的功能分析中顯示，聚糖上調(diào)的糖蛋白主要參與ROS生物合成，膠原蛋白代謝和免疫過程，下調(diào)的糖蛋白主要參與ROS代謝，胚胎發(fā)育，精卵識別和生殖過程（圖3G）。進(jìn)一步的聚糖結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，膠原代謝偏好Lewisx/a 結(jié)構(gòu)，生殖過程富含復(fù)雜聚糖和LacdiNAc分支結(jié)構(gòu)，ROS更偏向展現(xiàn)不同核心/分支結(jié)構(gòu)變化（圖3H-K）。
這些結(jié)果表明，糖基化不僅是被動(dòng)標(biāo)記，還可能主動(dòng)調(diào)控特定通路和生理功能。
圖3 卵巢衰老過程中的位點(diǎn)特異性糖基化改變
在驗(yàn)證蛋白糖基化修飾的功能時(shí)，我們可以從以下幾個(gè)角度入手——
表型關(guān)聯(lián)：敲除特定糖基轉(zhuǎn)移酶（如FUT8敲除巖藻糖化），觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)變化及下游通路激活。
機(jī)制解析：通過糖鏈結(jié)構(gòu)定點(diǎn)突變（CRISPR-Cas9基因編輯或利用糖基轉(zhuǎn)移酶等），驗(yàn)證糖鏈修飾對蛋白活性（如酶促反應(yīng)）的影響。
多組學(xué)整合：聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組/蛋白組，區(qū)分糖基化修飾與蛋白表達(dá)水平的獨(dú)立調(diào)控。
如果需要進(jìn)一步探究蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)，可以參考以下策略——
質(zhì)譜解析：采用MALDI-TOF或LC-MS/MS鑒定糖鏈組成（如LacdiNAc分支）。
凝集素芯片：利用凝集素定量糖鏈豐度。
功能聚類：根據(jù)糖鏈結(jié)構(gòu)（如Lewisx/a）將差異糖肽映射至特定通路。
| 三黍服務(wù) | 技術(shù)參數(shù) |
Astral DIA 血液低豐度蛋白組分析 | |
極微量蛋白組分析 | |
PRM蛋白相對含量分析 | |
真核轉(zhuǎn)錄組測序 | |
ChIP-Seq(動(dòng)物，轉(zhuǎn)錄因子/組蛋白修飾) | |
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5.核心巖藻糖在卵巢衰老中成高頻率變化
衰老卵巢上下調(diào)前10位的聚糖中，巖藻糖基化呈現(xiàn)了高頻變化，而唾液酸主要呈增加趨勢。其中，不同類型的巖藻糖對應(yīng)不同的生物學(xué)功能，核心巖藻糖化偏向免疫、黏附和應(yīng)激反應(yīng)，天線巖藻糖化則與酶活和代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，卵巢衰老是多通路，多位點(diǎn)調(diào)控的結(jié)果（圖3L-N）。
上下調(diào)居前的聚糖類型（如核心巖藻糖化）通常指向關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)。
高頻上調(diào)：可能驅(qū)動(dòng)病理進(jìn)程。
機(jī)制解析：提示功能喪失。
分析各類聚糖的上/下調(diào)情況，有助于快速鎖定疾病相關(guān)糖鏈（如卵巢衰老中的LacdiNAc），為靶向干預(yù)（如酶替代療法）提供依據(jù)。
6.LacdiNAc糖鏈隨透明帶衰退而減少
作者統(tǒng)計(jì)了具有不同結(jié)構(gòu)特征的糖鏈在衰老卵巢中的比例，發(fā)現(xiàn)排名前四的均為LacdiNAc相關(guān)分支結(jié)構(gòu)，且在衰老卵巢中明顯減少。免疫組化的結(jié)果顯示，催化LacdiNAc合成的關(guān)鍵酶 B4GALNT3和B4GALNT4在衰老卵巢中的表達(dá)水平顯著降低，使用Cy5標(biāo)記的WFA凝聚素染色也證實(shí)了該現(xiàn)象（圖4A-D）。
共識別到50個(gè)糖蛋白相關(guān)的176個(gè)LacdiNAc糖肽，主要位于細(xì)胞質(zhì)，胞外區(qū)域，囊泡，高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和透明帶。從14種糖蛋白中鑒定到55種變化糖肽，其中8種在衰老卵巢中上調(diào)，47種下調(diào)（圖E-G）。
在下調(diào)的LacdiNAc糖肽中，主要來自透明帶的糖蛋白ZP2、ZP3和ASTL，與精卵結(jié)合，多精阻止以及透明帶變性和生育能力下降等功能密切相關(guān)。上調(diào)的糖蛋白則與酶活性調(diào)節(jié)相關(guān)，多定位于高爾基體和胞外，功能與老化應(yīng)答相關(guān)（圖4H-K）。
圖4 LacdiNAc糖鏈隨透明帶衰退而減少
7.Neu5Ac和Neu5Gc在免疫調(diào)控中發(fā)揮不同作用
Neu5Ac和Neu5Gc是唾液酸的兩種主要類型，僅有一個(gè)氧原子不同，結(jié)果中鑒定到了468種和86種僅被二者修飾的糖蛋白，且這些唾液酸糖肽大多數(shù)在衰老卵巢的糖基化水平上增加（圖5A-D）。二者在免疫功能上也存在偏好性，Neu5Ac與整合素相關(guān)，如T細(xì)胞活化等，Neu5Gc與免疫球蛋白相關(guān)，參與補(bǔ)體激活，防御反應(yīng)等（圖5E）。
唾液酸的分支結(jié)構(gòu)也會(huì)影響糖蛋白的功能。如Lewisx/a修飾中，Neu5Ac偏向免疫激活，Neu5Gc偏向酶調(diào)控；LacNAc中，Neu5Ac與應(yīng)急響應(yīng)強(qiáng)相關(guān)。天線唾液酸中，Neu5Gc與生殖過程起關(guān)鍵作用（圖5F）。
這些結(jié)果表明，唾液酸的類型和分支結(jié)構(gòu)都有可能影響其修飾的糖蛋白的免疫作用。
圖5 Neu5Ac和Neu5Gc的增加在衰老卵巢中發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用
8.信號通路中涉及的糖基化變化
在進(jìn)一步的分析中，作者整合了磷酸化和蛋白組的數(shù)據(jù)，對發(fā)生改變的糖肽/糖蛋白進(jìn)行了通路分析。磷酸化分析中共識別到6022個(gè)位點(diǎn)，來自2554個(gè)磷酸化蛋白（圖6A-C）。在衰老卵巢中，共有142個(gè)上調(diào)磷酸肽和36個(gè)蛋白，下調(diào)中有142個(gè)磷酸肽和73個(gè)蛋白（圖6D-E）。多組學(xué)的通路整合分析中，共有62條共富集通路，主要包括補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、抗原處理與呈遞、鐵死亡和細(xì)胞凋亡。這些通路通常與卵巢功能下降和免疫微環(huán)境紊亂相關(guān)，是卵巢衰老的典型特征（圖6F-G）。
亞細(xì)胞定位中，參與信號通路的相關(guān)糖蛋白集中在細(xì)胞表面，差異磷酸化蛋白集中在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。這表明糖基化改變可能位于磷酸化調(diào)控的上游位置。
PPI分析結(jié)果表明，前10個(gè)關(guān)鍵信號節(jié)點(diǎn)中有9個(gè)為糖蛋白。且不同類型的糖鏈涉及了不同的信號通路，其中，補(bǔ)體、凝血通路富含唾液酸化LacdiNAc，antenna-Neu5Ac LacNAc和terminal-Neu5Gc Lewisx/a。抗原呈遞中則主要為LacdiNAc，antenna-Neu5Ac LacNGc分支結(jié)構(gòu)（圖6H-M）。
圖6 糖基化和磷酸化在信號通路中的不同作用
在通路分析中，鐵死亡和細(xì)胞凋亡都因上調(diào)的糖肽而富集，且都在糖基化水平上升，而不是蛋白水平，并被不同的糖鏈結(jié)構(gòu)修飾（圖7A）。與鐵死亡相關(guān)的糖肽以復(fù)合聚糖為特征，主要存在于細(xì)胞表面，參與細(xì)胞凋亡的糖肽則主要以寡甘露糖為特征，并位于溶酶體（圖7B-C），細(xì)胞定位的不同可能是糖鏈結(jié)構(gòu)差異的原因。鐵死亡相關(guān)糖肽富集了唾液酸修飾，可能通過鐵攝取激活死亡通路（圖7D-E）。
圖7 與鐵死亡和細(xì)胞凋亡相關(guān)的不同糖型
糖基化修飾與信號通路的關(guān)聯(lián)研究揭示了其在疾病機(jī)制中的多維調(diào)控作用。
以鐵死亡為例，這一由脂質(zhì)過氧化驅(qū)動(dòng)的程序性細(xì)胞死亡過程，其發(fā)生與胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能抑制密切相關(guān)。唾液酸化修飾的糖蛋白在鐵死亡通路上調(diào)，且這些糖鏈多定位于細(xì)胞表面，提示其可能通過調(diào)控膜蛋白的穩(wěn)定性或受體互作影響鐵離子攝取。
進(jìn)一步的多組學(xué)整合策略（糖蛋白組+磷酸化組）可揭示修飾級聯(lián)效應(yīng)：糖基化通過改變蛋白構(gòu)象（如遮蔽磷酸化位點(diǎn)等）間接調(diào)控下游信號。
研究思路總結(jié)：
通過“糖鏈結(jié)構(gòu)解析→亞細(xì)胞定位→通路富集→功能實(shí)驗(yàn)”的鏈條，可將糖基化修飾精準(zhǔn)關(guān)聯(lián)至特定醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)，為疾病機(jī)制解析及干預(yù)策略設(shè)計(jì)提供創(chuàng)新思路。
| 三黍服務(wù) | 技術(shù)參數(shù) |
Astral DIA 磷酸化修飾蛋白組分析 | |
4D-DIA 泛素化修飾蛋白組分析 | |
4D-DIA 乙酰化修飾蛋白組分析 | |
非靶代謝組學(xué) | |
非靶脂質(zhì)組學(xué) | |
更多服務(wù)，歡迎私信詳詢！ | |
在本項(xiàng)研究中，作者通過蛋白組、N-糖基化蛋白組和磷酸化蛋白組，輔以免疫組化等分子實(shí)驗(yàn)，首次分析了衰老過程中的卵巢糖基化景觀，主要匯總了與細(xì)胞粘附和免疫反應(yīng)相關(guān)的核心巖藻糖基化頻繁變化，導(dǎo)致生育能力下降的透明帶上的 LacdiNAc 聚糖減少，以及由 Neu5Ac 和 Neu5Gc 修飾的唾液酸化聚糖增加在免疫激活和反應(yīng)中發(fā)揮不同的作用，還進(jìn)一步分析了糖基化在關(guān)鍵通路中的作用。該研究為衰老卵巢提供了糖生物學(xué)的新觀點(diǎn)，為卵巢功能保護(hù)與延緩衰老提供了潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。
糖基化可串聯(lián)鐵死亡、免疫治療、衰老等多個(gè)科研熱點(diǎn)，并從“結(jié)構(gòu)解析”到“動(dòng)態(tài)修飾網(wǎng)絡(luò)”，全方位揭示翻譯后修飾的時(shí)空調(diào)控規(guī)律。結(jié)合AI驅(qū)動(dòng)的糖鏈預(yù)測模型和原位編輯技術(shù)，可更有效地推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展。
總結(jié)一下結(jié)合糖蛋白熱點(diǎn)的研究主要框架——
科學(xué)問題：聚焦疾病特異性糖鏈（如腫瘤相關(guān)抗原）。
技術(shù)路線：糖蛋白組+功能驗(yàn)證（凝集素阻斷/酶活性檢測）。
臨床轉(zhuǎn)化：開發(fā)糖質(zhì)標(biāo)志物檢測試劑盒或糖優(yōu)化藥物。
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排版：野凌
審核：三黍生物企宣部
