單細胞測序技術能夠提供前所未有的細胞分辨率，揭示組織內不同細胞類型之間的異質性。其分析難點主要在于：如何從繁雜的數據中發現線索，并通過分析和后續濕實驗來驗證該線索。
因此不僅需要了解該疾病的病理過程（研究方向，如有藥物還要了解藥理等信息）、疾病相關組織的病理特點和過程、參與某個病理過程的細胞群及其功能表型、調控細胞群表型的分子和機制等信息，還需要了解驗證某個線索需要用到的分析方法、實驗方法以及該方法的優勢和局限性。
在擁有單細胞測序數據后，如何有效地設計研究思路以最大化利用這些寶貴的信息呢？以下是一份基于單細胞測序數據分析的研究設計方案。
以特定細胞群為主要創新點的思路設計
對所有細胞進行分群和注釋后，我們通常可以獲得幾個~十幾個細胞類群，各個細胞類群也可以進一步細分為多個亞群。那么如何挑選目標細胞類群呢？基于已發表的經典文章可以歸納出以下策略。
如在免疫相關的單細胞研究中，T細胞等免疫細胞往往會被細分為多個細胞亞群，其中新的亞群可能起到關鍵作用，可作為腫瘤免疫治療的新靶點。
2024年發表于Nature 的泛癌單細胞研究表明[1]，新的T細胞亞群—干細胞樣CD4 T細胞在抗腫瘤免疫中發揮關鍵作用。
圖1 在小鼠癌癥模型中識別出TCF1+lin?干細胞樣CD4 T細胞群體
在深入解析細胞亞群異質性時，單細胞測序技術的分辨率直接影響亞群鑒定的精準度。
10×單細胞轉錄組測序（3'端）采用優化標記策略，穩定捕獲低豐度轉錄本，尤其適合干細胞樣CD4 T細胞這類稀有亞群的基因表達圖譜構建。
特有微流控分選系統，實現數千個細胞并行捕獲，配合分析流程亞群聚類算法，表達模式差異較小的細胞亞型也能有效區分，為發現治療新靶點提供可靠數據支撐。
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在發育分化、疾病進程、免疫應答等進程中，特定細胞類型的相對比例改變可能反映出細胞分化過程的變化。此外，細胞比例變化也可以反映組織內環境的穩態調節。在腫瘤研究中，不同細胞類型的比例變化可能與腫瘤侵襲、轉移、免疫逃逸等密切相關。可重點關注在疾病中比例中“顯著升高或者降低”的細胞群以及在疾病中功能相關的細胞群。
2.1 在疾病中比例“顯著升高或者降低”的細胞群
挑選在不同比較組間細胞比例發生顯著變化的細胞類型，這個細胞群在疾病組（或者干預組）比對照組（或者疾病組）的比例顯著升高和降低。
圖2 CAF亞群在多癌種中的細胞占比情況[2]
2.2 與疾病中功能相關的細胞群
如2024年發表在nature communications的文章中[3]，通過單細胞測序（主要技術）分析了CD（研究疾病類型）患者的末端回腸和升結腸細胞，發現了一種與CD相關的特殊上皮細胞類型“LND”（關鍵細胞群）能與免疫細胞相互作用，在CD活躍期中發揮作用。
圖3 與克羅恩病相關的特殊上皮細胞類型的鑒定和多模式表征
疾病進程中細胞比例的動態變化是反映病理機制的核心，當研究聚焦于疾病相關細胞群體的功能解析時，多維度數據整合尤為重要。
針對疾病中顯著波動的細胞群體，10×單細胞轉錄組測序（5'端）憑借其高分辨率的細胞分型能力，可準確識別豐度發生顯著改變的細胞類型。
整合TCR/BCR分析模塊，能精準量化不同細胞類型豐度差異，同步解析免疫細胞的克隆擴增特征，揭示免疫細胞克隆動態演變，為解析細胞比例變化機制提供關鍵線索。
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如2023年發表在nature communications的文章中[4]，為了識別 T2D 患者中可能失調的基因，對四種主要內分泌細胞類型（α、β、δ 和 γ 細胞）的病例和對照組進行了差異 ASE 分析，結果表明在2型糖尿病數據集中，DAESC用于識別胰腺內分泌細胞中患者和對照之間的幾種差異調節基因。
圖4 克胰腺內分泌細胞中 2 型糖尿病患者和對照組之間的差異 ASE
基因表達的組間差異分析是揭示疾病機制的重要突破口，染色質可及性分析為基因表達差異的調控根源研究提供了新的維度。
10×單細胞ATAC測序技術精準繪制細胞類型特異的開放染色質圖譜，幫助發現類似內分泌細胞中差異ASE基因的上游調控機制，為疾病相關通路解析提供表觀遺傳學證據。
與轉錄組數據互補，共同鎖定疾病關鍵調控元件，揭示疾病相關基因表達失調的深層原因。
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當研究目標較為清晰時，可以基于細胞注釋結果，挑選與研究目標最相關的細胞類群進行后續分析。
例如在2024年發表于Journal of clinical investagation的巨噬細胞亞群在心臟修復中的作用機制研究中[5]，巨噬細胞作為心臟主要免疫細胞，具有促炎和促修復的雙重功能，但其亞群的異質性及作用機制尚不明確。新生兒心臟具有短暫再生能力，而出生后10天及成年后心臟喪失這一能力，巨噬細胞亞群的動態變化可能是關鍵因素。所以作者對巨噬細胞進行單細胞H3K27ac ChIP - seq和scRNA - seq，分析細胞亞型、功能異質性及相關轉錄因子和增強子，通過體內外實驗驗證，揭示其功能和命運決定機制。
圖5 巨噬細胞亞群注釋和基因功能結果
針對特定細胞類型的機制研究，定制化分析方案可顯著提升研究效率。當研究目標明確指向特定細胞類群時，精準的數據挖掘策略尤為關鍵。
單細胞測序高級分析服務支持個性化流程設計，定制從亞型鑒定到調控網絡構建的全套解決方案，助力揭示細胞命運決定的核心機制。
結合表觀遺傳與轉錄組數據，系統性解析細胞亞群功能異質性及動態調控網絡。
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當疾病相關的細胞群被篩選到以后，可以對該亞群與其他細胞亞群進行差異基因分析，得到差異基因list后我們則知道該亞群上下調了哪些基因，能幫助我們解釋致病的機制或尋找致病的靶點，當然，這需要我們去查詢各種基因的背景、功能。
接下來，可以進行功能分析，以進一步尋找致病機制或縮小差異基因的范圍。可以從細胞、通路、分子的維度出發。
細胞層面有軌跡分析細胞、相互作用分析等。軌跡分析可以判斷聚焦的細胞亞群的來源或去路，緊接著上面的例子，我們可以對各種細胞亞群進行軌跡分析，看看細胞亞群的軌跡變化情況。
細胞相互作用分析可以聚焦感興趣的核心亞群，看哪些細胞與核心亞群作用變化明顯，可直接找到亞群甚至相互作用的表面蛋白。
通路層面則有GO，KEGG，GSEA，IPA等分析，對差異基因進行富集，尋找與疾病相關的信號通路。
分子層面最基本的還是分析差異基因。
此外通過轉錄因子分析，SCENIC分析可以發現調控基因表達的轉錄因子，其本身也是蛋白（同樣有基因表達），我們可以進一步縮小差異基因的范圍。
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[1] Cardenas M A , Prokhnevska N , Sobierajska E ,et al.Author Correction: Differentiation fate of a stem-like CD4 T cell controls immunity to cancer[J]. Nature:1-1[2024-1119].DOI:10.1038/s41586-024-08303-1.
[2] Ma C, Yang C, Peng A,et al. Pan-cancer spatially resolved single-cell analysis reveals the crosstalk between cancer-associated fibroblasts and tumor microenvironment.[J]. Mol Cancer:[2023-08-13]. DOI: 10.1186/s12943-023-01876-x.
[3] Li J, Simmons AJ, Hawkins CV, Chiron S, et al. Identification and multimodal characterization of a specialized epithelial cell type associated with Crohn's disease[J].Nature Communications: [2024-08-22].DOI:10.1038/s41467-024-51580-7.
[4] Qi G , Strober B J , Popp J M ,et al.Single-cell allele-specific expression analysis reveals dynamic and cell-type-specific regulatory effects[J].Nature Communications, 2023, 14(1).DOI:10.1038/s41467-023-42016-9.
[5] Fu M , Jia S , Xu L ,et al.Single-cell multiomic analysis identifies macrophage subpopulations in promoting cardiac repair[J].Journal of Clinical Investigation, 2024, 134(19):20.DOI:10.1172/JCI175297 .
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