在之前的文章中，我們?yōu)榇蠹医榻B了3-6個(gè)月完成的多糖“短平快”發(fā)文策略：（詳細(xì)案例分析可點(diǎn)擊下方鏈接）
文獻(xiàn)速覽 | 3個(gè)月即可完成！保姆級(jí)多糖研究短平快發(fā)文策略，優(yōu)選期刊列表建議轉(zhuǎn)發(fā)收藏！
對(duì)于普通研究者而言，總結(jié)短平快的發(fā)文思路：
1. 多糖的提取、除雜，結(jié)合相應(yīng)的活性研究
2. 多糖的提取純化和基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)表征，結(jié)合細(xì)胞活性研究
如果想要進(jìn)一步提高標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到Carbohydrate Polymers這樣IF 10+/Q1的水平，文章又需要具備怎樣的條件呢？
在多糖研究領(lǐng)域，我們常用的多糖結(jié)構(gòu)研究和活性研究角度包括：
三黍生物多糖檢測(cè)服務(wù)，歡迎私信了解詳情！
在本期解讀的文獻(xiàn)中，是如何合理、高效率利用這些檢測(cè)技術(shù)，完成研究思路設(shè)計(jì)的？結(jié)合上述兩個(gè)層面，如何產(chǎn)出一篇高質(zhì)量的多糖研究文章？
一起來(lái)看這篇以天然多糖為研究對(duì)象的Carbohydrate Polymers文章是如何設(shè)計(jì)的吧！
骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種以以軟骨損傷為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病，主要影響老年人。骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制現(xiàn)在被廣泛理解為涉及軟骨成分的改變，和對(duì)機(jī)械損傷的易感性的增加。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致軟骨的漸進(jìn)性侵蝕和結(jié)構(gòu)完整性受損。臨床研究表明，長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素地塞米松（Dex）可增加患骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)，甚至可能加速骨關(guān)節(jié)炎患者的疾病進(jìn)程。因此，尋找新的、安全、有效的天然產(chǎn)品來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎愈加重要。浙江金線蘭（Anoectochilus zhejiangensis ，AZJ），又稱(chēng)“萬(wàn)靈藥”，具有增強(qiáng)免疫功能、抗氧化、抗肝、降血糖、抗腫瘤、降壓、抗炎和抗關(guān)節(jié)炎作用，但目前關(guān)于AZJ的研究非常有限。因此，從AZJ中發(fā)現(xiàn)和評(píng)價(jià)新型多糖是一個(gè)具有巨大潛力的研究領(lǐng)域。
本文從浙江金線蘭中成功提取純化了4種新型均質(zhì)多糖AZJP- 1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，包括原子力顯微鏡（AFM）、剛果紅分析、場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（FESEM）、氣相色譜-質(zhì)譜甲基化分析和核磁共振波譜，還利用轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚(yú)模型評(píng)估了軟骨修復(fù)活性，為其軟骨保護(hù)潛力提供了有價(jià)值的見(jiàn)解，并強(qiáng)調(diào)了其多糖的結(jié)構(gòu)多樣性。
研究材料：浙江金線蘭、熒光斑馬魚(yú)模型
技術(shù)方法：多糖純度、蛋白含量、分子量、單糖組成、甲基化分析、核磁分析、原子力顯微鏡（AFM）、剛果紅實(shí)驗(yàn)、場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（FESEM）、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
技術(shù)路線：
圖1 實(shí)驗(yàn)思路
1.AZJ多糖的分離
AZJ經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離純化后得到AZJP-1、AZJP-2、AZJP-3和AZJP-4。將AZJP-1、AZJP-2再次通過(guò)G-200柱純化，然后濃縮、透析、冷凍干燥得到4個(gè)純化多糖，分別命名為AZJP-1a（圖2B）、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c（圖2C），總糖含量均高于95%，蛋白含量較低，可忽略不計(jì)。
圖2 AZJ的分離純化
2.分子量
用HPGPC法測(cè)定了多糖的分子量和純度。如圖3A所示，AZJP-1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c表現(xiàn)出均勻、對(duì)稱(chēng)的特征峰，保留時(shí)間不同，這表明這四種多糖具有較高的純度，且分子量分別為387.083 kDa、947.069 kDa、3.989 kDa和3.045 kDa。
圖3 AZJ中多糖的化學(xué)特征
3.單糖組成
AZJP-1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c的單糖組成如圖3B所示，AZJP-1a主要由甘露糖（96.10 %）組成，其次是少量半乳糖（2.83 %）、葡萄糖（0.64 %）、阿拉伯糖（0.27 %）和半乳糖醛酸（0.15 %）；AZJP-2a是一種雜多糖，主要由半乳糖（53.22 %）、阿拉伯糖（23.46 %）、葡萄糖（19.47 %）組成；AZJP-2b與AZJP-2a具有相似的單糖組成，AZJP-2b中葡萄糖（84.17 %）的含量顯著高于AZJP-2a，而AZJP-2b中半乳糖（11.32 %）、甘露糖（0.63 %）、阿拉伯糖（3.52 %）、半乳糖醛酸（0.16 %）和葡萄糖醛酸（0.19 %）的含量相對(duì)低于AZJP-2a。AZJP-2c主要由葡萄糖（97.59 %）和少量的半乳糖組成。
4.剛果紅三螺旋結(jié)構(gòu)分析
剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4a所示，AZJP樣品的最大吸收波長(zhǎng)在任何氫氧化鈉濃度下都沒(méi)有明顯的紅移，說(shuō)明AZJP都不具有三螺旋結(jié)構(gòu)。場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（FESEM）表明，AZJP-1a表現(xiàn)出球形和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表面孔隙數(shù)量增加，可能是由于多糖內(nèi)存在廣泛的支鏈相互作用。相比之下，AZJP-2a表現(xiàn)出粗糙、致密、呈現(xiàn)球形和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙更少、更小，表面聚集不規(guī)則，這些特征表明，AZJP-2a具有較高的分子量和分支程度，導(dǎo)致糖鏈緊密相互作用。AZJP-2b顯示出條帶狀結(jié)構(gòu)，表面有可見(jiàn)的孔隙，有助于增強(qiáng)其水溶性。同樣，在5000×放大下，AZJP-2c的表面有許多孔狀結(jié)構(gòu)，具有不規(guī)則的卷繞和細(xì)絲交聯(lián)。雖然AZJP- 2b和AZJP-2c表現(xiàn)出卷曲的結(jié)構(gòu)特征，通常有利于三螺旋的形成，但它們的低分子量可能破壞了氫鍵，阻止了這種結(jié)構(gòu)的形成，這一觀察結(jié)果與剛果紅試驗(yàn)的結(jié)果一致。
原子力顯微鏡（AFM）如圖4c所示，AZJP-1a主要表現(xiàn)為不規(guī)則的塊狀聚集物，以及短的、隨機(jī)方向的鏈。AZJP-2a主要采用不規(guī)則的塊狀層狀聚集物的構(gòu)象，從其外圍伸出長(zhǎng)枝。AZJP-2b主要以一種柔性鏈為代表。同時(shí)，AZJP-2c主要以隨機(jī)鏈為主，兩側(cè)伴有短分支。此外，從圖4c中可以看出，這四種多糖的表面表現(xiàn)為一定程度的粗糙度，這是由多糖鏈相互作用的結(jié)果。在所有四種多糖中，形態(tài)顯示的聚集體峰值明顯高于單個(gè)多糖鏈的高度（0.1-1nm），表明分子聚集在所有樣品中都普遍存在，這是由不同程度的分支和支鏈長(zhǎng)度的差異導(dǎo)致的。
圖4 AZJP-1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c的形態(tài)學(xué)分析
5.多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析
甲基化分析表明，.AZJP-1a的主要單糖殘基包括Manp-(1→，Galp-（1→，→4）-Galp-（1→，→4）-Manp-（1→，→3,4）-Manp-（1→，→4,6）-Manp-(1→；AZJP-2a主要包括Araf-（1→→-（1→→3）-Araf-（1→→Glcp（1→→→→4）-1→→4）-Glcp（1→→3）-（1→→3、4）Glcp-1→→2,4）Glcp（1→→4,6）-Galp（1→→3,6）-Galp(1→；AZJP-2b由Glcp-(1→，→4）-Galp-（1→，→4）-Glcp-（1→，→3,4）-Galp-（1→，→4,6）-Glcp-（1→組成。AZJP-2c主要由Glcp-（1→，→4）-Galp-（1→，→4）-Glcp-（1→，→3,4）-Glcp-（1→，和→4,6）-Glcp-(1→組成，這些→以特定的序列排列。
表1 甲基化結(jié)果
核磁掃描解析結(jié)果，AZJP-1a的主鏈主要由→4)-β-D-Galp（1→、→3,4）-α-D-Manp（1→、→4,6）-β-D-Manp（1→和→4）-α-D-Manp(1→組成，側(cè)鏈主要由α-D-Manp-(1→組成，少量α-D-Galp（1→鏈接在→3,4）-α-D-Manp（1→和→4,6）-β-D-Manp(1→的O-4，O-3和O-6位置（圖5）。AZJP-2a主鏈由→4)-α-D-Glcp-(1 → 6)-β-D-Galp-(1→,→6)-β-DGalp-(1 → 4)-α-D-Glcp-(1→,→3)-α-D-Glcp-(1 → 3)-α-D-Glcp-(1→, →3)- α-D-Glcp-(1 → 4)-β-D-Galp-(1→,→4)-β-D-Galp-(1 → 4)-α-D-Glcp-(1→, →4)-α-D-Glcp-(1 → 2)-α-D-Glcp-(1→,→2)-α-D-Glcp-(1 → 3)-β-D-Galp- (1→,→3)-β-D-Galp-(1 → 3)-β-D-Galp-(1→,→3)-β-D-Galp-(1 → 4)-β-DGalp-(1→,and→4)-β-D-Galp-(1 → 4)-β-D-Galp-(1→,有不同長(zhǎng)度的支鏈在不同的位置（圖5）。AZJP-2b的主鏈主要由→4)-α-D-Galp（1→，→4）-α-D-Glcp（1→，→3、4）-β-D-Galp（1→和→4,6）-α-D-Glcp-(1→（圖5）。AZJP-2c的主鏈主要由→4)-β-D-Galp（1→，→4）-α-DGlcp（1→，→3,4）-α-D-Glcp（1→和→4,6）-α-D-Glcp-(1→組成（圖5）。
圖5 核磁結(jié)果
6.斑馬魚(yú)模型中四種多糖對(duì)軟骨的保護(hù)作用的評(píng)價(jià)
當(dāng)幼蟲(chóng)暴露于從3 dpf到9 dpf的12.5 μM右美托咪定時(shí)，與正常組相比，顱面軟骨的熒光強(qiáng)度明顯下降（圖6B）。當(dāng)幼蟲(chóng)暴露于AZJP-1a、2a、2b和2c和阿侖膦酸鈉（0.308 μM）時(shí)，觀察到軟骨細(xì)胞損傷的顯著挽救（圖6C-10O）。此外，斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)顱面軟骨的熒光強(qiáng)度也隨著多糖濃度的變化而發(fā)生不同程度的變化。這一結(jié)果在很大程度上歸因于多糖的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，其生物活性受到各種因素的影響，包括分子量、單糖組成、糖殘基、連接模式和鏈構(gòu)象。
圖6 在9 dpf時(shí)，斑馬魚(yú)頭部軟骨的腹側(cè)視圖
從AZJ中純化了四種新的多糖，即AZJP-1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c。這些多糖的分子量從3 kDa到388 kDa不等。單糖組成分析表明，AZJP-1a主要由甘露糖組成，而AZJP-2a、2b和2c則表現(xiàn)出多種多樣的糖成分，包括葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。AZJP-1a和2a具有分支網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，AZJP-2b和2c具有條紋絲狀結(jié)構(gòu)，且這四種多糖都不具有三螺旋結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚(yú)軟骨修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AZJPs具有軟骨保護(hù)作用，可能作為一種潛在的骨關(guān)節(jié)炎治療藥物。
滑動(dòng)查看更多：
排版：野凌
審核：三黍生物企宣部
