一起來看這篇以天然多糖為研究對象的Carbohydrate Polymers文章是如何設計的吧！

背景

骨關節(jié)炎（OA）是一種以以軟骨損傷為特征的退行性關節(jié)疾病，主要影響老年人。骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制現(xiàn)在被廣泛理解為涉及軟骨成分的改變，和對機械損傷的易感性的增加。隨著時間延長，會導致軟骨的漸進性侵蝕和結(jié)構完整性受損。臨床研究表明，長期使用糖皮質(zhì)激素地塞米松（Dex）可增加患骨關節(jié)炎的風險，甚至可能加速骨關節(jié)炎患者的疾病進程。因此，尋找新的、安全、有效的天然產(chǎn)品來治療骨關節(jié)炎愈加重要。浙江金線蘭（Anoectochilus zhejiangensis ，AZJ），又稱“萬靈藥”，具有增強免疫功能、抗氧化、抗肝、降血糖、抗腫瘤、降壓、抗炎和抗關節(jié)炎作用，但目前關于AZJ的研究非常有限。因此，從AZJ中發(fā)現(xiàn)和評價新型多糖是一個具有巨大潛力的研究領域。

本文從浙江金線蘭中成功提取純化了4種新型均質(zhì)多糖AZJP- 1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c，對多糖結(jié)構進行表征，包括原子力顯微鏡（AFM）、剛果紅分析、場發(fā)射掃描電鏡（FESEM）、氣相色譜-質(zhì)譜甲基化分析和核磁共振波譜，還利用轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚模型評估了軟骨修復活性，為其軟骨保護潛力提供了有價值的見解，并強調(diào)了其多糖的結(jié)構多樣性。

研究材料：浙江金線蘭、熒光斑馬魚模型

技術方法：多糖純度、蛋白含量、分子量、單糖組成、甲基化分析、核磁分析、原子力顯微鏡（AFM）、剛果紅實驗、場發(fā)射掃描電鏡（FESEM）、動物實驗

技術路線：

圖1 實驗思路

1.AZJ多糖的分離

AZJ經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離純化后得到AZJP-1、AZJP-2、AZJP-3和AZJP-4。將AZJP-1、AZJP-2再次通過G-200柱純化，然后濃縮、透析、冷凍干燥得到4個純化多糖，分別命名為AZJP-1a（圖2B）、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c（圖2C），總糖含量均高于95%，蛋白含量較低，可忽略不計。

圖2 AZJ的分離純化

2.分子量

用HPGPC法測定了多糖的分子量和純度。如圖3A所示，AZJP-1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c表現(xiàn)出均勻、對稱的特征峰，保留時間不同，這表明這四種多糖具有較高的純度，且分子量分別為387.083 kDa、947.069 kDa、3.989 kDa和3.045 kDa。

圖3 AZJ中多糖的化學特征

3.單糖組成

AZJP-1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c的單糖組成如圖3B所示，AZJP-1a主要由甘露糖（96.10 %）組成，其次是少量半乳糖（2.83 %）、葡萄糖（0.64 %）、阿拉伯糖（0.27 %）和半乳糖醛酸（0.15 %）；AZJP-2a是一種雜多糖，主要由半乳糖（53.22 %）、阿拉伯糖（23.46 %）、葡萄糖（19.47 %）組成；AZJP-2b與AZJP-2a具有相似的單糖組成，AZJP-2b中葡萄糖（84.17 %）的含量顯著高于AZJP-2a，而AZJP-2b中半乳糖（11.32 %）、甘露糖（0.63 %）、阿拉伯糖（3.52 %）、半乳糖醛酸（0.16 %）和葡萄糖醛酸（0.19 %）的含量相對低于AZJP-2a。AZJP-2c主要由葡萄糖（97.59 %）和少量的半乳糖組成。

4.剛果紅三螺旋結(jié)構分析

剛果紅實驗結(jié)果如圖4a所示，AZJP樣品的最大吸收波長在任何氫氧化鈉濃度下都沒有明顯的紅移，說明AZJP都不具有三螺旋結(jié)構。場發(fā)射掃描電鏡（FESEM）表明，AZJP-1a表現(xiàn)出球形和網(wǎng)狀結(jié)構，表面孔隙數(shù)量增加，可能是由于多糖內(nèi)存在廣泛的支鏈相互作用。相比之下，AZJP-2a表現(xiàn)出粗糙、致密、呈現(xiàn)球形和網(wǎng)狀結(jié)構，孔隙更少、更小，表面聚集不規(guī)則，這些特征表明，AZJP-2a具有較高的分子量和分支程度，導致糖鏈緊密相互作用。AZJP-2b顯示出條帶狀結(jié)構，表面有可見的孔隙，有助于增強其水溶性。同樣，在5000×放大下，AZJP-2c的表面有許多孔狀結(jié)構，具有不規(guī)則的卷繞和細絲交聯(lián)。雖然AZJP- 2b和AZJP-2c表現(xiàn)出卷曲的結(jié)構特征，通常有利于三螺旋的形成，但它們的低分子量可能破壞了氫鍵，阻止了這種結(jié)構的形成，這一觀察結(jié)果與剛果紅試驗的結(jié)果一致。

原子力顯微鏡（AFM）如圖4c所示，AZJP-1a主要表現(xiàn)為不規(guī)則的塊狀聚集物，以及短的、隨機方向的鏈。AZJP-2a主要采用不規(guī)則的塊狀層狀聚集物的構象，從其外圍伸出長枝。AZJP-2b主要以一種柔性鏈為代表。同時，AZJP-2c主要以隨機鏈為主，兩側(cè)伴有短分支。此外，從圖4c中可以看出，這四種多糖的表面表現(xiàn)為一定程度的粗糙度，這是由多糖鏈相互作用的結(jié)果。在所有四種多糖中，形態(tài)顯示的聚集體峰值明顯高于單個多糖鏈的高度（0.1-1nm），表明分子聚集在所有樣品中都普遍存在，這是由不同程度的分支和支鏈長度的差異導致的。

圖4 AZJP-1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c的形態(tài)學分析

5.多糖的化學結(jié)構分析

甲基化分析表明，.AZJP-1a的主要單糖殘基包括Manp-(1→，Galp-（1→，→4）-Galp-（1→，→4）-Manp-（1→，→3,4）-Manp-（1→，→4,6）-Manp-(1→；AZJP-2a主要包括Araf-（1→→-（1→→3）-Araf-（1→→Glcp（1→→→→4）-1→→4）-Glcp（1→→3）-（1→→3、4）Glcp-1→→2,4）Glcp（1→→4,6）-Galp（1→→3,6）-Galp(1→；AZJP-2b由Glcp-(1→，→4）-Galp-（1→，→4）-Glcp-（1→，→3,4）-Galp-（1→，→4,6）-Glcp-（1→組成。AZJP-2c主要由Glcp-（1→，→4）-Galp-（1→，→4）-Glcp-（1→，→3,4）-Glcp-（1→，和→4,6）-Glcp-(1→組成，這些→以特定的序列排列。

表1 甲基化結(jié)果

核磁掃描解析結(jié)果，AZJP-1a的主鏈主要由→4)-β-D-Galp（1→、→3,4）-α-D-Manp（1→、→4,6）-β-D-Manp（1→和→4）-α-D-Manp(1→組成，側(cè)鏈主要由α-D-Manp-(1→組成，少量α-D-Galp（1→鏈接在→3,4）-α-D-Manp（1→和→4,6）-β-D-Manp(1→的O-4，O-3和O-6位置（圖5）。AZJP-2a主鏈由→4)-α-D-Glcp-(1 → 6)-β-D-Galp-(1→,→6)-β-DGalp-(1 → 4)-α-D-Glcp-(1→,→3)-α-D-Glcp-(1 → 3)-α-D-Glcp-(1→, →3)- α-D-Glcp-(1 → 4)-β-D-Galp-(1→,→4)-β-D-Galp-(1 → 4)-α-D-Glcp-(1→, →4)-α-D-Glcp-(1 → 2)-α-D-Glcp-(1→,→2)-α-D-Glcp-(1 → 3)-β-D-Galp- (1→,→3)-β-D-Galp-(1 → 3)-β-D-Galp-(1→,→3)-β-D-Galp-(1 → 4)-β-DGalp-(1→,and→4)-β-D-Galp-(1 → 4)-β-D-Galp-(1→,有不同長度的支鏈在不同的位置（圖5）。AZJP-2b的主鏈主要由→4)-α-D-Galp（1→，→4）-α-D-Glcp（1→，→3、4）-β-D-Galp（1→和→4,6）-α-D-Glcp-(1→（圖5）。AZJP-2c的主鏈主要由→4)-β-D-Galp（1→，→4）-α-DGlcp（1→，→3,4）-α-D-Glcp（1→和→4,6）-α-D-Glcp-(1→組成（圖5）。

圖5 核磁結(jié)果

6.斑馬魚模型中四種多糖對軟骨的保護作用的評價

當幼蟲暴露于從3 dpf到9 dpf的12.5 μM右美托咪定時，與正常組相比，顱面軟骨的熒光強度明顯下降（圖6B）。當幼蟲暴露于AZJP-1a、2a、2b和2c和阿侖膦酸鈉（0.308 μM）時，觀察到軟骨細胞損傷的顯著挽救（圖6C-10O）。此外，斑馬魚幼蟲顱面軟骨的熒光強度也隨著多糖濃度的變化而發(fā)生不同程度的變化。這一結(jié)果在很大程度上歸因于多糖的復雜結(jié)構，其生物活性受到各種因素的影響，包括分子量、單糖組成、糖殘基、連接模式和鏈構象。

圖6 在9 dpf時，斑馬魚頭部軟骨的腹側(cè)視圖