肝臟極易受到損傷，但目前關(guān)于肝臟損傷的治療藥物仍有缺陷，因此以飲食為基礎(chǔ)的干預(yù)措施來預(yù)防或治療肝臟損傷受到了越來越多人關(guān)注。玉米絲是肝保護食品的重要來源，但其主要由纖維素組成，常規(guī)水提醇沉法難以將其完全提取出來。植物乳桿菌是一種異發(fā)酵的嗜微氧革蘭氏陽性微生物，具有高抗氧化能力和肝保護作用，在其基因組中編碼多種糖苷酶，主要來自糖基水解酶家族，其中α-淀粉酶、β-木糖苷酶和阿拉伯糖尿苷酶均可切斷半纖維素的糖苷鍵，因此植物發(fā)酵有助于降解和釋放玉米絲多糖，更加安全高效。
本文旨在建立一種通過熱水提取結(jié)合植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)玉米絲多糖的方法，并研究其對急性肝損傷的治療潛力，并利用該策略，通過柱層析法獲得并純化了兩種高支化的多糖，采用HPGPC法測定其分子量分布，通過結(jié)合甲基化-氣相色譜-質(zhì)譜和核磁共振的方法對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進行了詳細的表征，在CCl4誘導(dǎo)的小鼠模型上評價了其對急性肝損傷的作用，并討論了其構(gòu)效關(guān)系。
研究對象：干玉米絲、植物乳桿菌、AML-12（小鼠肝實質(zhì)）細胞
技術(shù)方法：分子量、單糖組成、粘度、紫外光譜、紅外光譜、電鏡、熱重分析、甲基化分析、核磁光譜、細胞活力測定
技術(shù)路線：
圖1 實驗思路
1.多糖的理化表征
玉米絲多糖經(jīng)過除雜（D301R樹脂）、DEAE純化后，得到F-CSP-W和F-CSP-S兩個組分（圖2a），分子量分別為4818 Da和9772 Da。
圖2 玉米絲多糖的純化和分子量結(jié)果
F-CSP-W的粘度測定為11.59 mPa.s，在濃度為5 mg/mL時，F(xiàn)-CSP-S的粘度值為10.75 mPa.s。紫外光譜在200~800nm范圍內(nèi)呈光滑曲線，在250~300nm處吸收較弱，表明餾分中存在少量雜質(zhì)（圖3a）。熱重分析結(jié)果（圖3b、c）發(fā)現(xiàn)，降解過程可分為三個階段，首先，在30-200?C之間觀察到大約10 %的重量損失，并由于結(jié)合水的損失而出現(xiàn)明顯的吸熱行為。其次，F(xiàn)-CSP-W在224-284?C時重量顯著下降（40 %），而F-CSP-S在222-356?C時由于高溫分解，導(dǎo)致環(huán)單元破碎，產(chǎn)生水和揮發(fā)，進一步表明，當溫度低于200?C時，F(xiàn)-CSP-W/S保持穩(wěn)定。紅外光譜結(jié)果顯示，F(xiàn)-CSP-W與F-CSP-S之間的FT-IR光譜無明顯差異（圖3e)。F-CSP-W/S的XRD模式在20?（2θ）處顯示出寬的衍射峰，表明多糖的非晶聚合結(jié)構(gòu)（圖3d)。
圖3 F-CSP-W和F-CSP-S的化學(xué)和物理表征
2.多糖的結(jié)構(gòu)表征
F-CSP-W主要由Glc、Gal、Xyl、Ara、GlcN和Man等組成；而F-CSP-S主要由Glc、Gal、Xyl、Ara、次要GlcA、GalA、Man、Rha和GlcN等單糖組成（圖4）。甲基化分析，結(jié)果表明，F(xiàn)-CSP-W主要由1→4-Glcp、1→4-Xylp、1→6-Glcp、1→3-Glcp和1→2-Xylp組成，含有少量的1→2-Arap，分支為1→5-Arap（表1）。F-CSP-S主要由1→4-Glcp組成，分支為1個→4,6-Glcp。其中，Glcp的數(shù)量顯著減少，而Xylp和Galp的殘基數(shù)量顯著增加，表明其分支度高于F-CSP-W（表2）。
圖4 F-CSP-W和F-CSP-S的單糖組成
表1 F-CSP-W的甲基化結(jié)果
表2 F-CSP-S的甲基化結(jié)果
采用核磁進一步分析F-CSP-W和F-CSP-S的結(jié)構(gòu)（圖5和圖6），F(xiàn)-CSPW和F-CSP-S主要由α-1→4-Glcp、β-1→4-Xylp、α-Araf和α-Galp組成；此外，根據(jù)目前的信息，這兩個組分都具有高度的分支結(jié)構(gòu)。側(cè)鏈被認為是阿拉伯木聚糖的溶劑化結(jié)構(gòu)域，阿拉伯木聚糖是禾本科植物中主要的半纖維素，與植物乳桿菌容易獲取的糖苷酶底物相一致，其結(jié)構(gòu)特征被確定為β-1→4-Xyl骨架，α-Ara和4-O-Me-α-t-Glcp UA分支被取代。此外，F(xiàn)-CSP-S具有更復(fù)雜的果膠樣側(cè)鏈與阿拉伯木聚糖共價結(jié)合，其中含有α-1→4-GalUA和1→2-Rhap部分甲基酯化的典型殘基（表3）。
圖5 F-CSP-W和F-CSP-S的核磁解析
表3 F-CSP-W和F-CSP-S的核磁結(jié)果
圖6 F-CSP-W和F-CSP-S的糖鏈連接方式
3.對四氯化碳致急性肝損傷的肝保護作用
通過評價自由基活性氧的清除能力、四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷后肝臟指數(shù)和血清ALT和TBIL、H&E染色法和TUNEL染色法發(fā)現(xiàn)，首先，發(fā)酵并不影響玉米絲多糖的活性，因為發(fā)酵和未發(fā)酵的多糖都具有抗氧化和保護肝的活性；其次，Zhang等人證實了玉米絲多糖通過線粒體凋亡途徑保護乙醇誘導(dǎo)的肝細胞損傷，從而抑制caspase級聯(lián)反應(yīng)。因此，這些多糖的肝保護作用可能部分獨立于其抗氧化能力；最后，根據(jù)不同來源肝保護多糖的結(jié)構(gòu)比較，主干中Gal和Glc的含量以及阿拉伯木聚糖側(cè)鏈的抗肝損傷作用，但葡萄糖醛酸的分子量分布和含量與活性無關(guān)。
圖7 F-CSP-W/S的體外抗氧化活性和肝保護活性
圖8 多糖對四氯化碳（CCl?）誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的療效
綜上所述，從玉米絲中提取，有效地提取了兩種高分支多糖。與僅用熱水提取相比，產(chǎn)量提高了約3倍，顯示出工業(yè)規(guī)模多糖生產(chǎn)的高潛力。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-CSP-W/S主鏈為α-1→3-Galp，分支為α-1→4-Glcp，阿拉伯木聚糖的溶劑化結(jié)構(gòu)域主要由β-1→4-Xyl、α-Ara和4-O-Me-α-t-GlcpUA作為側(cè)鏈組成。F-CSP-S具有較高的分支度，果膠樣側(cè)鏈與阿拉伯木聚糖共價結(jié)合。此外，F(xiàn)-CSP-W/S是預(yù)防和治療急性肝損傷的有效藥物，為功能性食品的開發(fā)提供了堅實的基礎(chǔ)，且Gal和Glc的含量以及阿拉伯木聚糖的側(cè)鏈在發(fā)揮肝保護作用中均起關(guān)鍵作用，而其他結(jié)構(gòu)特征則不相關(guān)。
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審核：三黍生物企宣部
