肝臟極易受到損傷，但目前關于肝臟損傷的治療藥物仍有缺陷，因此以飲食為基礎的干預措施來預防或治療肝臟損傷受到了越來越多人關注。玉米絲是肝保護食品的重要來源，但其主要由纖維素組成，常規水提醇沉法難以將其完全提取出來。植物乳桿菌是一種異發酵的嗜微氧革蘭氏陽性微生物，具有高抗氧化能力和肝保護作用，在其基因組中編碼多種糖苷酶，主要來自糖基水解酶家族，其中α-淀粉酶、β-木糖苷酶和阿拉伯糖尿苷酶均可切斷半纖維素的糖苷鍵，因此植物發酵有助于降解和釋放玉米絲多糖，更加安全高效。
本文旨在建立一種通過熱水提取結合植物乳桿菌發酵生產玉米絲多糖的方法，并研究其對急性肝損傷的治療潛力，并利用該策略，通過柱層析法獲得并純化了兩種高支化的多糖，采用HPGPC法測定其分子量分布，通過結合甲基化-氣相色譜-質譜和核磁共振的方法對其化學結構進行了詳細的表征，在CCl4誘導的小鼠模型上評價了其對急性肝損傷的作用，并討論了其構效關系。
研究對象：干玉米絲、植物乳桿菌、AML-12（小鼠肝實質）細胞
技術方法：分子量、單糖組成、粘度、紫外光譜、紅外光譜、電鏡、熱重分析、甲基化分析、核磁光譜、細胞活力測定
技術路線：
圖1 實驗思路
1.多糖的理化表征
玉米絲多糖經過除雜（D301R樹脂）、DEAE純化后，得到F-CSP-W和F-CSP-S兩個組分（圖2a），分子量分別為4818 Da和9772 Da。
圖2 玉米絲多糖的純化和分子量結果
F-CSP-W的粘度測定為11.59 mPa.s，在濃度為5 mg/mL時，F-CSP-S的粘度值為10.75 mPa.s。紫外光譜在200~800nm范圍內呈光滑曲線，在250~300nm處吸收較弱，表明餾分中存在少量雜質（圖3a）。熱重分析結果（圖3b、c）發現，降解過程可分為三個階段，首先，在30-200?C之間觀察到大約10 %的重量損失，并由于結合水的損失而出現明顯的吸熱行為。其次，F-CSP-W在224-284?C時重量顯著下降（40 %），而F-CSP-S在222-356?C時由于高溫分解，導致環單元破碎，產生水和揮發，進一步表明，當溫度低于200?C時，F-CSP-W/S保持穩定。紅外光譜結果顯示，F-CSP-W與F-CSP-S之間的FT-IR光譜無明顯差異（圖3e)。F-CSP-W/S的XRD模式在20?（2θ）處顯示出寬的衍射峰，表明多糖的非晶聚合結構（圖3d)。
圖3 F-CSP-W和F-CSP-S的化學和物理表征
2.多糖的結構表征
F-CSP-W主要由Glc、Gal、Xyl、Ara、GlcN和Man等組成；而F-CSP-S主要由Glc、Gal、Xyl、Ara、次要GlcA、GalA、Man、Rha和GlcN等單糖組成（圖4）。甲基化分析，結果表明，F-CSP-W主要由1→4-Glcp、1→4-Xylp、1→6-Glcp、1→3-Glcp和1→2-Xylp組成，含有少量的1→2-Arap，分支為1→5-Arap（表1）。F-CSP-S主要由1→4-Glcp組成，分支為1個→4,6-Glcp。其中，Glcp的數量顯著減少，而Xylp和Galp的殘基數量顯著增加，表明其分支度高于F-CSP-W（表2）。
圖4 F-CSP-W和F-CSP-S的單糖組成
表1 F-CSP-W的甲基化結果
表2 F-CSP-S的甲基化結果
采用核磁進一步分析F-CSP-W和F-CSP-S的結構（圖5和圖6），F-CSPW和F-CSP-S主要由α-1→4-Glcp、β-1→4-Xylp、α-Araf和α-Galp組成；此外，根據目前的信息，這兩個組分都具有高度的分支結構。側鏈被認為是阿拉伯木聚糖的溶劑化結構域，阿拉伯木聚糖是禾本科植物中主要的半纖維素，與植物乳桿菌容易獲取的糖苷酶底物相一致，其結構特征被確定為β-1→4-Xyl骨架，α-Ara和4-O-Me-α-t-Glcp UA分支被取代。此外，F-CSP-S具有更復雜的果膠樣側鏈與阿拉伯木聚糖共價結合，其中含有α-1→4-GalUA和1→2-Rhap部分甲基酯化的典型殘基（表3）。
圖5 F-CSP-W和F-CSP-S的核磁解析
表3 F-CSP-W和F-CSP-S的核磁結果
圖6 F-CSP-W和F-CSP-S的糖鏈連接方式
3.對四氯化碳致急性肝損傷的肝保護作用
通過評價自由基活性氧的清除能力、四氯化碳誘導的急性肝損傷后肝臟指數和血清ALT和TBIL、H&E染色法和TUNEL染色法發現，首先，發酵并不影響玉米絲多糖的活性，因為發酵和未發酵的多糖都具有抗氧化和保護肝的活性；其次，Zhang等人證實了玉米絲多糖通過線粒體凋亡途徑保護乙醇誘導的肝細胞損傷，從而抑制caspase級聯反應。因此，這些多糖的肝保護作用可能部分獨立于其抗氧化能力；最后，根據不同來源肝保護多糖的結構比較，主干中Gal和Glc的含量以及阿拉伯木聚糖側鏈的抗肝損傷作用，但葡萄糖醛酸的分子量分布和含量與活性無關。
圖7 F-CSP-W/S的體外抗氧化活性和肝保護活性
圖8 多糖對四氯化碳（CCl?）誘導的小鼠急性肝損傷的療效
綜上所述，從玉米絲中提取，有效地提取了兩種高分支多糖。與僅用熱水提取相比，產量提高了約3倍，顯示出工業規模多糖生產的高潛力。結構分析發現，F-CSP-W/S主鏈為α-1→3-Galp，分支為α-1→4-Glcp，阿拉伯木聚糖的溶劑化結構域主要由β-1→4-Xyl、α-Ara和4-O-Me-α-t-GlcpUA作為側鏈組成。F-CSP-S具有較高的分支度，果膠樣側鏈與阿拉伯木聚糖共價結合。此外，F-CSP-W/S是預防和治療急性肝損傷的有效藥物，為功能性食品的開發提供了堅實的基礎，且Gal和Glc的含量以及阿拉伯木聚糖的側鏈在發揮肝保護作用中均起關鍵作用，而其他結構特征則不相關。
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