芒果（Mangifera indica L.）是一種享有盛譽(yù)的熱帶水果，以其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)成分而聞名。矮化栽培技術(shù)的應(yīng)用使得樹(shù)木更小、更易于管理，具有早果、高產(chǎn)和穩(wěn)定生產(chǎn)等優(yōu)良特性，已成為芒果產(chǎn)業(yè)的主要趨勢(shì)。研究表明，植物高度與赤霉素（GA）的合成和代謝密切相關(guān)，其生物合成涉及多個(gè)中間體，其中GA1、GA3、GA4和GA7具有最高的生物活性，被稱(chēng)為活性GA。維持GA的穩(wěn)態(tài)對(duì)于優(yōu)化植物生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要，因此，對(duì)GA生物合成的研究在不同物種中得到了廣泛的開(kāi)展。廣西亞熱帶作物研究所的莫永龍團(tuán)隊(duì)（第一作者張宇博士）在《International Journal of Molecular Sciences》期刊上發(fā)表文章Over Expression of Mango MiGA2ox12 in Tobacco Reduced Plant Height by Reducing GA1 and GA4 Content，鑒定出芒果中的MiGA2ox12基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)赤霉素含量來(lái)控制植物的高度。
研究材料：芒果（Mangifera indica L.）、煙草
技術(shù)方法：生物信息學(xué)分析、煙草轉(zhuǎn)化、表型觀察測(cè)量、高效液相色譜測(cè)定、實(shí)時(shí)熒光定量PCR
1. 鑒定和特征化芒果中的MiGA2ox蛋白
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)使用擬南芥的8個(gè)GA2ox序列(AtGA2oxs)，對(duì)芒果基因組進(jìn)行全面分析，成功鑒定出14個(gè)MiGA2ox蛋白，并根據(jù)其在染色體上的位置命名。這些蛋白具有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如外顯子數(shù)量、氨基酸長(zhǎng)度、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等。由于具有保守的PLN02156或PLN02984域和獨(dú)特的motif，這些MiGA2ox蛋白能夠被分類(lèi)為三個(gè)不同的組，表明它們可能在功能上存在差異。
圖1. MiGA2ox 基因家族的鑒定和生物信息學(xué)分析
2. MiGA2ox蛋白的進(jìn)化分析
通過(guò)構(gòu)建基于最大似然（ML）方法的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，研究者將芒果、擬南芥和水稻的GA2ox蛋白分為三個(gè)不同的亞組：C19-GA2oxI、C19-GA2ox-II和C20-GA2ox-I。這一分類(lèi)基于它們的底物特異性，其中MiGA2ox6、MiGA2ox8和MiGA2ox9被歸入C19-GA2ox-I亞組，而MiGA2ox1、MiGA2ox7、MiGA2ox12和MiGA2ox13則屬于C19-GA2ox-II亞組。這種分類(lèi)揭示了MiGA2ox蛋白可能的底物特異性和進(jìn)化關(guān)系。
圖2. 芒果、水稻和擬南芥的 GA2ox 蛋白家族的 ML 系統(tǒng)發(fā)育分析3.MiGA2ox啟動(dòng)子中的順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)
研究還對(duì)MiGA2ox基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行了分析，以預(yù)測(cè)其順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。這些元件與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、激素調(diào)節(jié)和非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)。研究特別發(fā)現(xiàn)MiGA2ox基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有多種順式作用元件，這表明其在調(diào)節(jié)芒果生長(zhǎng)和發(fā)育以及響應(yīng)脅迫和激素信號(hào)中可能發(fā)揮重要作用。
圖3. 存在于 MiGAox 啟動(dòng)子中的順式作用元件4.MiGA2ox基因的表達(dá)
利用RNA-seq數(shù)據(jù)分析MiGA2ox基因在不同芒果組織中的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，MiGA2ox1、MiGA2ox10、MiGA2ox11和MiGA2ox12在特定組織中表達(dá)量較高，而其他基因在所有檢測(cè)的組織中的表達(dá)水平相對(duì)較低。特別是MiGA2ox12在根、樹(shù)皮、葉和花中的表達(dá)量顯著高于其他組織，表明這一基因可能在芒果的生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
圖4. MiGA2ox 基因在各種組織和器官中的表達(dá)譜5.MiGA2ox12基因的克隆、比對(duì)和亞細(xì)胞定位
隨后，研究者克隆了MiGA2ox12基因，并使用RACE技術(shù)從芒果品種“Guiqi”中獲取該基因的完整序列。通過(guò)與Alphonso品種的基因序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)了位于蛋白序列第129位的單核苷酸多態(tài)性（SNP）。序列比對(duì)顯示MiGA2ox12與其他已知的GA2ox家族成員具有高度的序列保守性，特別是DIOX_N和2OG-FeII_Oxy這兩個(gè)功能域。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)中，MiGA2ox12-GFP融合蛋白在煙草葉片中的綠色熒光與NLS-RFP的紅色熒光完全重合，表明MiGA2ox12蛋白定位于細(xì)胞核，為理解其在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用提供了重要信息。
圖5. MiGA2ox 蛋白的比對(duì)和亞細(xì)胞定位分析6.構(gòu)建煙草植物中MiGA2ox12的過(guò)表達(dá)、敲除和互補(bǔ)株系
研究者通過(guò)35S啟動(dòng)子成功構(gòu)建了MiGA2ox12過(guò)表達(dá)載體，并利用潮霉素篩選得到了14個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草植株。其中OE4和OE22植株的MiGA2ox12表達(dá)量最高，被選為過(guò)表達(dá)株系。為了敲除NbGA2ox5基因，本研究設(shè)計(jì)了sgRNA并用卡那霉素篩選，成功獲得CR13和CR38兩個(gè)敲除株系。在CR38背景下，通過(guò)共轉(zhuǎn)化得到15個(gè)互補(bǔ)株系，其中CR-OE10和CR-OE20因表達(dá)差異顯著被選為研究對(duì)象，為研究MiGA2ox12的功能提供了重要依據(jù)。
圖6. 過(guò)表達(dá) MiGA2ox12 植物鑒定7.MiGA2ox12通過(guò)降解GA1和GA4抑制煙草植物高度
過(guò)表達(dá)MiGA2ox12基因的煙草植株表現(xiàn)出矮化表型，而敲除其同源基因NtGAox5的植株高度則有所增加。盡管具有敲除背景的植株比野生型植株高，但MiGA2ox12的過(guò)表達(dá)仍然誘導(dǎo)矮化表型。此外，敲除和敲除互補(bǔ)株系的莖直徑明顯大于野生型，表明MiGA2ox12不僅影響植株高度，還可能影響莖的粗細(xì)。這些結(jié)果表明MiGA2ox12通過(guò)降解GA1和GA4來(lái)調(diào)節(jié)植物高度。
圖7. GA2ox 基因?qū)煵葜参锉硇秃?GAs 含量的影響本研究揭示了芒果中GA2ox基因家族的組成和功能，特別是MiGA2ox12基因在調(diào)控植物高度方面的作用。通過(guò)基因鑒定、生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)研究，研究者發(fā)現(xiàn)MiGA2ox12通過(guò)降解活性赤霉素GA1和GA4來(lái)抑制煙草植物的高度。此外，該基因在細(xì)胞核內(nèi)的定位表明它可能參與調(diào)控植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)不僅增進(jìn)了對(duì)芒果生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制的理解，而且為利用基因技術(shù)改良作物提供了新的策略。盡管MiGA2ox12在芒果中的具體作用還需進(jìn)一步研究，但目前的成果為培育具有理想生長(zhǎng)特性的芒果新品種提供了科學(xué)依據(jù)。
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排版：野凌
審核：三黍生物企宣部
