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2024.10.24

客戶文章 | IF 7.7/Q1：山藥多糖負(fù)載氫氧化鋁納米顆粒作為疫苗佐劑誘導(dǎo)有效的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)

研究背景

與病毒和細(xì)菌減毒活疫苗或全滅活疫苗相比，亞單位疫苗具有較高的安全性，但免疫活性較弱。為了克服這一缺點，需要佐劑來提高免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持久性，從而提供有效的保護(hù)性免疫。鋁佐劑是應(yīng)用最廣泛的佐劑，在過去的一個世紀(jì)中具有良好的安全記錄和廣譜能力，可以增強(qiáng)對多種抗原的免疫力。不幸的是，鋁佐劑主要引起Th2體液免疫反應(yīng)，但不能引起Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。然而，細(xì)胞免疫反應(yīng)通常對細(xì)胞內(nèi)病原體的保護(hù)性免疫至關(guān)重要。

近年來，大量研究表明，從中藥中提取的多糖具有良好的免疫刺激活性、生物相容性和生物安全性，具有發(fā)展成為疫苗免疫刺激劑或佐劑的潛力。山藥多糖是山藥的主要生物活性成分之一，具有多種生物活性。據(jù)報道，山藥中的多糖具有抗便秘、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗氧化等活性。

近日，國際期刊《International Journal of Biological Macromolecules》（Top一區(qū)）發(fā)表了題為“Chinese yam polysaccharide-loaded aluminium hydroxide nanoparticles used as vaccine adjuvant to induce potent humoral and cellular immune responses”的研究性論文。該研究從河北省道地藥材“祁山藥”中提取、分離和純化得到一種水溶性的山藥多糖（CYP），分子量為9.931 kDa，主要是由→4)-α-D-Glcp-(1→和少量→4,6)-α-D-Glcp-(1→等相互連接形成主鏈，支鏈主要由α-D-Glcp-(1→連接在糖殘基→4,6)-α-D-Glcp-(1→的O-6位置構(gòu)成。體外試驗證明，提取的山藥多糖具有良好的免疫刺激作用。為了進(jìn)一步提升山藥多糖的免疫增強(qiáng)作用，該論文成功制備了氫氧化鋁納米顆粒，其主要成分是結(jié)晶的AlO(OH)，尺寸為納米級（長度約為120 nm），形狀為細(xì)棒狀。將山藥多糖負(fù)載于氫氧化鋁納米粒構(gòu)建了山藥多糖-氫氧化鋁納米粒佐劑遞送系統(tǒng)（CYP-Al NPs）。這項研究表明，CYP-Al NPs可作為一種有效的疫苗佐劑遞送系統(tǒng)，從而大大拓展了鋁佐劑的應(yīng)用潛力。

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研究思路

1.采用水提醇沉法提取CYP，并通過DEAE-纖維素柱和Sephacryl S-400 HR柱進(jìn)行純化。然后選用傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜、紫外-可見光譜、甲基化分析和核磁共振(NMR)光譜等方法分析確定CYP的結(jié)構(gòu)特征。

2.采用共沉淀法制備Al NPs，選用X射線粉末衍射儀(XRD)、X射線光電子能譜儀（XPS）、FT-IR光譜，透射電鏡(TEM)和動態(tài)光散射(DLS)等方法對Al NPs和CYP-Al NPs進(jìn)行表征。

3.將CYP負(fù)載到Al NPs形成CYP-AlNPs，通過體內(nèi)外實驗評估CYP-AlNPs作為疫苗佐劑的佐劑活性。

研究結(jié)果

1. 山藥多糖的制備及結(jié)構(gòu)表征

經(jīng)熱水提取和乙醇沉淀，得到山藥中總多糖。通過DEAE-纖維素柱和Sephacryl S-400 HR柱純化，得到純化后的CYP。紫外線掃描在200-400 nm波長范圍內(nèi)沒有明顯的CYP被吸收，說明CYP不含核酸和蛋白質(zhì)。CYP的Mw和Mn分別為9.931 kDa和9.822 kDa。多分散性(Mw/Mn)為1.011，窄分子量分布表明CYP是一種純度較高的相對均勻的多糖。CYP的SEM圖顯示CYP為片狀結(jié)構(gòu)，帶有一些桿狀附著體。值得注意的是，CYP的主要單糖成分是葡萄糖，這表明它的骨鏈可能由葡萄糖殘基組成。此外，CYP不含糖醛酸，表明它是中性多糖。

undefined 圖1. 山藥多糖的純化及結(jié)構(gòu)表征。

甲基化分析進(jìn)一步用于鑒定CYP的糖苷鍵。CYP含有5種糖苷鍵，分別為4-Glc(p)、t-Glc(p)、4,6-Glc (p)、3,4-Gal (p)和6-Glc(p)，摩爾百分比分別為65.88%、21.96%、9.09%、1.68%和1.39%。結(jié)果表明，4-Glc(p)糖苷鍵可能是CYP的主要骨架。相比之下，3,4-Gal (p)和6-Glc (p)糖苷鍵在CYP中所占的比例非常低。

為了進(jìn)一步分析CYP的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了核磁共振波譜分析，推測CYP主要是由→4)-α-D-Glcp-(1→和少量→4,6)-α-D-Glcp-(1→等相互連接形成主鏈，支鏈主要由α-D-Glcp-(1→連接在糖殘基→4,6)-α-D-Glcp-(1→的O-6位置構(gòu)成。

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圖2. CYP的一維核磁共振和二維核磁共振光譜

2. 納米顆粒的合成與表征

采用共沉淀法合成了Al NPs，并將CYP吸附在Al NPs上得到了CYP-Al NPs。表征結(jié)果顯示Al NPs主要由結(jié)晶的AlO(OH)和少量的Al(OH)3組成。TEM圖像顯示，Al NPs和CYP-Al NPs均為細(xì)長的棒狀納米顆粒。Al NPs的長度和直徑分別約為122 nm和13 nm, CYP-Al NPs的長度和直徑分別約為129 nm和19 nm。鋁凝膠佐劑呈聚集體形態(tài)。Al NPs和CYP-Al NPs具有良好的單分散性。用DLS法測定了Al NPs、CYP-Al NPs和鋁凝膠的水動力大小和zeta電位。結(jié)果表明，Alhydrogel具有較大的粒徑(約為225.3 nm)，而Al NPs和CYP-Al NPs在水中的粒徑要小得多，分別為359.1 nm和324.5 nm。Al NPs、CYP-Al NPs和Alhydrogel表面均帶正電荷，分別為27.6 mV、22.7 mV和27.1 mV。CYP的zeta電位為負(fù)電荷(約為-6.33 mV)。吸附CYP后，CYP-Al NPs的zeta電位略有下降。因此，CYP在Al NPs上的吸附可能是通過靜電相互作用進(jìn)行的。CYP-Al NPs的CYP-loaded(%)為57.43±2.730%。

圖3. XRD譜圖、高分辨率XPS光譜、FT-IR光譜和TEM圖像

3. CYP-Al NPs佐劑誘導(dǎo)高效的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答

將模型抗原OVA吸附在Al NPs、CYP-Al NPs和鋁凝膠上，并對小鼠進(jìn)行免疫，進(jìn)一步考察其在體內(nèi)的佐劑活性。此外，建立高劑量CYP組(CYP(High)-OVA)進(jìn)行比較。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP-Al NPs能夠顯著增強(qiáng)多糖的免疫活性，作為模式抗原的佐劑，CYP-Al NPs能夠促進(jìn)淋巴結(jié)中樹突狀細(xì)胞和生發(fā)中心B細(xì)胞的活化（圖4），誘導(dǎo)高效持久的抗體應(yīng)答（圖5），并促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活化（圖6）和Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)（圖7）。與商用Alhydrogel佐劑相比，CYP-Al NPs能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th1偏向免疫反應(yīng)。

圖4.初次免疫后第5天，CYP-Al NPs可促進(jìn)dLNs中DC和GC B細(xì)胞的活化

圖5.CYP-Al NPs誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)

圖6.CYP-Al NPs促進(jìn)CTL應(yīng)答

圖7. 培養(yǎng)48h后第28天脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-6細(xì)胞因子的水平

研究總結(jié)

本研究通過水提醇沉法從山藥中提取了水溶性山藥多糖并確定多糖的結(jié)構(gòu)表征。通過共沉淀法制備了氫氧化鋁納米顆粒，然后將兩者結(jié)合作為疫苗佐劑。CYP-Al NPs作為佐劑有效促進(jìn)淋巴結(jié)中DCs和GC B細(xì)胞的活化，并誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗原特異性抗體反應(yīng)，促進(jìn)Th1和Th2混合免疫應(yīng)答。此外，CYP-Al NPs佐劑能夠促進(jìn)CTL應(yīng)答，誘導(dǎo)IFN-γ和IL-6細(xì)胞因子的表達(dá)。研究結(jié)果表明，CYP-Al NPs具有作為疫苗佐劑的潛力，可同時誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

文章鏈接：DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.135914

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