【背景】

油莎草(學(xué)名:Cyperus esculentus L.)是莎[suō]草科莎草屬植物。它含有許多成分，包括淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、生物堿、酚類和類黃酮等，已被廣泛應(yīng)用于食品加工、生物醫(yī)藥和生物燃料開發(fā)等領(lǐng)域。文獻(xiàn)也證實(shí)了其保護(hù)胃腸道、降血糖等特性。

乙酰化、磺化、羧甲基化和磷酸化常被用于修飾多糖結(jié)構(gòu)，某些官能團(tuán)的引入改變了分子量和其他結(jié)構(gòu)特征，從而影響了生物功能特性。其中乙酰化可拉伸多糖分支，改變多糖鏈的空間排列，使羥基暴露，從而改變水溶性和疏水性。然而，改性對油莎草結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響尚不清楚。

本文研究了乙酰化對油莎草的結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)、熱穩(wěn)定性、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性的影響。   

【樣本類型】

油莎草多糖

【技術(shù)方法】

可溶性糖檢測，總蛋白含量測定，還原糖檢測，乙醛酸檢測，紫外光譜掃描、紅外光譜掃描、熱重、掃描電鏡、甲基化、核磁掃描、抗氧化活性檢測（DPPH自由基清除活性測定、羥自由基清除活性測定、ABTS自由基清除活性測定、鐵還原抗氧化能力測定、超氧陰離子清除活性測定），細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：抗炎能力測定、RAW264.7細(xì)胞損傷修復(fù)能力、ROS分泌促進(jìn)能力等。

【研究結(jié)果】

1、 乙酰化對油莎草多糖（CEP）的化學(xué)成分影響

乙酰化油莎草多糖（ACEP）的總糖、蛋白質(zhì)、還原糖和乙醛酸水平顯著低于CEP (P< 0.05)。CEP可能在改性過程中被降解，導(dǎo)致改性后各種化合物的量大幅減少。這些結(jié)果與之前的報(bào)告相似。

乙酰化前CEP表面粗糙，有凹陷、不均勻和粘附。乙酰化后，多糖顆粒破碎明顯，呈不規(guī)則片狀和短棒狀，結(jié)構(gòu)松散。這可能是由于CEP大多以聚集狀態(tài)發(fā)生，具有較強(qiáng)的分子間交聯(lián)，而乙酰化后分子間力降低，相關(guān)基團(tuán)被釋放。掃描電鏡觀察的多糖顆粒的表面形態(tài)是由分子間交聯(lián)引起的各種分子聚集引起的，這種聚集引起構(gòu)象變化，隨后產(chǎn)生獨(dú)特的形態(tài)特征。

圖1 CEP（A1，500 ×;A2， 1000x;A3， 2000 x;A4，5000 × ）和ACEP（A1，500 ×;A2， 1000x;A3， 2000 x;A4，5000 × ）的掃描電鏡圖片

2、乙酰化對CEP性質(zhì)的影響

CEP和ACEP的分子量分別為148和138 kDa，ACEP分子量的降低可能與多糖的降解有關(guān)（如圖2A和2B）。CEP和ACEP是由葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖組成的雜多糖，而乙酰化并沒有顯著改變單糖的組成，而只是影響了比例（如圖2C）。乙酰化可能導(dǎo)致乙酰化衍生物的分子量降低，但不會破壞多糖的主鏈。

CEP和ACEP在260 ~ 280 nm處有較弱的吸收峰，說明存在微量蛋白（如圖2D）。與CEP的FTIR結(jié)果相比(圖2E)， ACEP在1720 cm-1和1247 cm-1處有很強(qiáng)的吸收峰。這些分別代表乙酰酯基團(tuán)C-O和C-O拉伸振動(dòng)，表明乙酰基修飾成功。

乙酰化對CEP熱穩(wěn)定性的影響該實(shí)驗(yàn)證明了糖的穩(wěn)定性（如圖2F）。CEP和ACEP有三個(gè)減重階段：30°C - 200°C、200°C -375°C和375°C-800°C。在第二階段，ACEP降解速度更快，表明其具有更好的熱降解性能。但隨著溫度的升高，ACEP的重量變化相對緩慢，800℃時(shí)的剩余重量(12.46%)大于CEP(10.28%)。結(jié)果表明，乙酰化處理顯著提高了CEP的熱穩(wěn)定性。

圖2 (A、B) CEP和ACEP的HPLC洗脫圖譜。(C)標(biāo)準(zhǔn)單糖、CEP和ACEP(-鼠李糖、-阿拉伯糖、3-木糖、④-甘露糖，-葡萄糖，-半乳糖)(D) CEP和ACEP的紫外光譜。(E) CEP和ACEP的FTIR光譜。(F) CEP和ACEP的TGA。

3、 乙酰化對CEP抗氧化能力的影響

CEP和ACEP均能有效清除DPPH自由基（如圖A），且乙酰化能增強(qiáng)CEP的清除能力。與DPPH結(jié)果相似，乙酰化提高了CEP對ABTS自由基(如圖B)、對OH自由基(如圖C)、FRAP自由基(如圖D) 、超氧陰離子自由基(如圖E)的清除能力。綜上所述，乙酰化多糖的抗氧化活性優(yōu)于天然乙酰化多糖。

植物多糖清除自由基的能力受其分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響。乙酰化修飾可以改變多糖的理化性質(zhì)，從而改善其水溶性和生物活性。先前的研究表明，乙酰基可能取代多糖的C-2和/或C-3，而雜資本碳（heterocapital carbon）的氫原子活化增加了所得衍生物的供氫能力。在本研究中，ACEP的抗氧化能力超過CEP，這可能是由于引入了乙酰基以提高供氫能力。在CEP的C-2和C-6位置上取代的乙酰基可以激活端粒碳的氫原子。除了乙酰基本身外，多糖的組成和相對分子質(zhì)量也與多糖的生物活性有關(guān)。低分子量多糖可以取代更多的羥基末端來消除自由基。改性后的CEP分子量降低，可能是其具有較強(qiáng)的自由基清除能力的原因。多項(xiàng)研究表明，化學(xué)修飾可以通過改變多糖的組成來提高多糖的抗氧化活性， Ara和Gal含量較高的多糖抗氧化活性更高。SEM結(jié)果也證實(shí)了ACEP的表面更加展開，這增加了其在溶液中的接觸面積，有助于提高ACEP的自由基清除率，從而賦予其優(yōu)越的抗氧化能力。

圖3 (A) CEP和ACEP對DPPH自由基的清除活性。(B) CEP和ACEP對ABTS自由基的清除活性。(C) CEP和ACEP對eOH自由基的清除活性。(D) CEP和ACEP對FRAP自由基的清除活性。(E) CEP和ACEP對眼自由基的清除活性。數(shù)值表示為平均值±SD (n = 3)。

4、 乙酰化對lps誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞CEP抗炎活性的影響

如圖4A所示，CEP和ACEP對RAW 264.7細(xì)胞存活率無顯著影響(P > 0.05)。

如圖4B所示，與對照組相比，LPS顯著降低了RAW 264.7細(xì)胞的活力(P < 0.05)。與CEP和ACEP孵育后，RAW 264.7細(xì)胞存活率從CEP的76%提高到86%，ACEP的93%，顯著提高(P< 0.05)。說明CEP和ACEP均能有效減輕LPS對RAW264.7細(xì)胞的免疫損傷，且ACEP的免疫保護(hù)作用強(qiáng)于CEP。

細(xì)胞形態(tài)倒置顯微鏡下觀察不同濃度CEP和ACEP(125、500和1000 μg/mL)對lps誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞形態(tài)的影響。如圖4C所示，對照組細(xì)胞呈圓形，生長正常。LPS處理后，細(xì)胞形態(tài)由橢圓變?yōu)樯扉L，大部分細(xì)胞開始漏漿。CEP或ACEP預(yù)孵育后，細(xì)胞形態(tài)有恢復(fù)趨勢，隨著濃度的增加，拉伸細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)與對照組更接近（圖片空白越多表明細(xì)胞受破壞程度越嚴(yán)重）。結(jié)果表明，CEP和ACEP都能夠修復(fù)lps誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞損傷，其中ACEP的修復(fù)能力更強(qiáng)。

圖4 (A) CEP和ACEP對RAW264.7細(xì)胞活力的影響。(B) CEP和ACEP對lps誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活力的影響。(C) CEP和ACEP對lps誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞形態(tài)的影響。Scar-100微米。用不同濃度的CEP或ACEP預(yù)處理細(xì)胞12 h，然后暴露于LPS (1 ug/ml)中12 h。倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。數(shù)值表示為平均值±SD (n=6)。“P< 0.05”，“P< 0.001”vs對照組。與LPS組比較，P< 0.05， **P< 0.001。

ROS分泌ROS是參與正常生理代謝活動(dòng)不可缺少的信號分子。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過多的ROS，刺激免疫反應(yīng)(Chu et al.， 2013)。如圖5所示，LPS (1 μg/mL)刺激12 h后，DCFH-DA熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，大部分細(xì)胞由圓形變?yōu)槔煨螒B(tài)，表明ROS濃度顯著升高。但不同濃度CEP和ACEP(125、500、1000 μg/mL)孵育細(xì)胞時(shí)，熒光強(qiáng)度呈劑量依賴性逐漸降低，且ACEP組熒光強(qiáng)度低于CEP組。上述結(jié)果表明，CEP和ACEP均能顯著抑制lps誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，其中乙酰化多糖的作用更大。

圖5 CEP或ACEP抑制LPS中ROS的生成。將細(xì)胞分別用不同濃度的CED或ACEP處理12 h，然后用LPS (1 ug/mL)處理12 h，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察細(xì)胞的變化。細(xì)胞的熒光顯微鏡圖像表示ROS。

【小結(jié)】

在這項(xiàng)研究中，作者對油莎草多糖及其乙酰化多糖的化學(xué)性質(zhì)、抗氧化特性和免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，CEP和ACEP是由葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖組成的雜多糖。CEP的主鏈包括a-1,4- glp殘基，分支點(diǎn)位于a-1,6- manp殘基的O-6位置。在一些葡萄糖殘基的O-2和O-6位置上取代了乙酰基。乙酰化顯著改善了ACEP的熱穩(wěn)定性，并表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。CEP和ACEP均能有效緩解和修復(fù)RAW264.7細(xì)胞的免疫損傷，抑制ROS的產(chǎn)生。ACEP的抗炎作用也比CEP更強(qiáng)。綜上所述，CEP和ACEP均可作為潛在的天然抗氧化劑或免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于食品科學(xué)和生物學(xué)。

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