【背景】
雞是生產蛋白質效率最高的動物之一，為人類提供了超過30%的肉制品，在全球糧食安全中發揮著重要作用。雖然世界上有數百個家養雞品種，但其肉類產量低，無法滿足人類的需求。快速生長的白羽肉雞被培育出來，通過對生產性狀的集約化選擇，雞的生產力不斷提高。此外，白羽肉雞的飼料轉化率是牛的10倍，但其碳排放量僅為牛的1/10。這與肉雞的高產肉量密切相關。然而，通過集約化選擇培育出的純種肉雞肉制品的遺傳基礎尚未得到充分研究。
2023年3月發表在Journal of Advanced Research上的題為“Large-scale genomic and transcriptomic analyses elucidate the genetic basis of high meat yield in chickens”的論文，對3個純種肉雞（n=748）和6個地方品種/系（n=114）進行了全基因組重測序，并從NCBI數據庫獲得了12個雞品種（n=199）的測序數據。此外，還對兩個雞品種（n=129）兩個發育階段的六種組織進行了轉錄組測序。隨后采用基因組關聯分析結合cis-eQTL定位和Mendel隨機化方法進行了分析。
【樣本類型】
3個純種肉雞（n=748），6個地方品種/系（n=114）
【技術方法】
全基因組測序，轉錄組測序，全基因組關聯分析，cis-eQTL定位和Mendel隨機化方法。
【圖形摘要】
【研究結果】
全基因組測序和變異
本研究共獲得了862只雞的全基因組序列，共7.7 Tb原始數據，平均深度為9.2倍，其余199只雞的其他序列來自SRA數據庫。采用嚴格的變異過濾后，在21個雞品種/品系中共檢測到17622141個高質量SNP。保留的SNP分布在整個基因組中，平均密度為每60個堿基1個SNP。經標注后，GGA16上的新SNP與已知SNP的比例最高，其中21.74%的SNP未被包含在dbSNP中(圖1B)。B系是長勢快速的純種肉雞，羽毛呈白色，攜帶所有變異SNP 8,663,580個，平均密度為每114個堿基中有1個SNP。其中只有4.7%的SNP被鑒定為新的變異。所有品種的大多數SNP都位于內含子和基因間區域。近幾十年來，在純種肉雞身上進行了對特定性狀的密集選擇，導致遺傳多樣性的減少，包括純種肉雞SNP數量和核苷酸多樣性的降低(圖1C-D)。圖中只展示了純種肉雞、野生祖先和一些典型的生長緩慢的地方品種雞。
圖1 21個雞品種/系基因組信息統計
系統發育和數量統計學分析
本研究對這些品種間的遺傳關系進行了綜合分析。首先，作者基于SNP對21個雞品種/品系進行PCA（圖2A）。進一步進行了遺傳共起源分析，通過改變推測的祖先群體數量將所有雞劃分為不同的群體（K=2-10，圖2B）。結果發現，品種B在基因上接近康沃爾雞品種，并且兩者都與BRp品種、本地雞品種和GGS品種分離。以GGS為外群，基于配對遺傳距離構建鄰接樹（圖2C）。結果顯示，快速生長的純種肉雞與GGS的遺傳距離很遙遠，這證明了對快速生長的純種肉雞具有更強的選擇力，這與純種肉雞連鎖不平衡衰減的結果相一致（圖2D）。然而，純種肉雞（594-720 kb）的連續純合片段長度略低于本地肉雞（509-1012 kb）和野生祖先（1198 kb）（圖2E）。純種肉雞（257，16.2%）的ROH數和平均基因組覆蓋率均高于本地雞（103，7.0%）和GGS（圖2E）。
圖2 種群遺傳多樣性與數量統計學歷史推斷
馴化和人工選擇后的遺傳負荷
馴化會導致有害突變在雞和其他家畜中積累。表1計算了每個基因組中有害的和同義的SNP的數量和頻率。結果顯示，在全基因組中，純種肉雞和地方雞的有害SNP（dSNP）分別比GGS多15.63%和24.05%。雖然3組間同義SNP的數量存在顯著差異，但肉雞和地方雞的dSNP與同義SNP的比例和dSNP的頻率高于GGS。總之，由于馴化和定向育種，在地方雞和肉雞中發現了快速積累的dSNP。接下來，通過比較雜合子和純合子dSNP的水平，發現肉雞和地方雞品種中分別有56.75%和69.85%的dSNP保持雜合子狀態，而GGS中的dSNP（50.90%）。與當地雞品種相比，純種肉雞攜帶更多的純合子（肉雞與當地雞544），雜合子較少（肉雞與當地雞1427，1885），純合和雜合dsnp的比例與當地雞品種之間表現出相似的趨勢（表1）。這些結果表明，dSNP主要是在雜合狀態下積累的，部分有害的SNP由于集約化養殖而消除。純種肉雞的基因組特征
為了推斷現代肉雞選擇性掃描的基因組位點，使用了基于XP-CLR和ZLSBL測試的等位基因頻率分化。結合這四種方法定義候選發散區域(四種方法中至少需要兩個信號)，窗口大小為40 kb，步長為20 kb(圖3A-B)。通過結合不同方法的結果，在純種肉雞群體中鑒定出包含163個蛋白質編碼基因和58個lncRNAs的391個窗口列表(圖3A-B)，58個lncRNAs被注釋為新基因。將育種相關的選擇性掃描與已知的QTL進行比較，發現選擇的ZLSBL分數和XP-CLR值較高但多樣性降低的區域涉及與肉類生產、免疫和肉質相關的QTL(圖3C)，反映了人類對肉類生產的需求以及育種方案下雞抗病能力的變化。在肉雞中，在GGA18上觀察到一個導聯信號，該信號注釋了肌球蛋白重鏈(MYH)基因家族成員(圖3A-B, D)。MYH1A、MYH1B、MYH1C等是肌球蛋白的組成成分和快肌纖維的標記物，參與骨骼肌的發育過程。此外，發現3個SNP在純種肉雞、地方雞和GGS之間存在明顯差異(圖3E)。例如，在純種肉雞中固定SNP rs740451868突變等位基因，而在其他動物中固定野生等位基因(圖3F)。除MYH基因家族外，肌肉發育相關基因IGF-1、INSR和SOX6被檢測到包含前1%的顯著分化區域。還發現了一份包含頂級選擇性掃窗的基因列表，這些基因在功能上對肉雞的馴化和定向育種是合理的。例如，TACR3和SLC26A8參與精子發生和運動；CPAMD8和INHBA與眼睛發育有關；GLI3參與了雞的色素沉著。基于表型或生理過程，GO術語被分為幾類，包括心臟發育過程(如GO:0008016、GO:0060047和GO:0060421)、肌肉功能(如GO:0051155、GO:0014834和GO:0006941)、生殖(如GO:0022412、GO:0046545、GO:0007292)、骨骼發育(GO:0060348)和感官(GO:1904058、GO:0021618)。
圖3 純種肉雞選擇性掃窗的檢測
純種肉雞和地方雞多組織多階段假定選擇基因（PSGs）的轉錄圖譜
為了進一步評估肉雞B品種和BJY雞組織中PSGs的表達豐度，研究者對6種組織進行了RNA測序，并計算了每個檢測到的基因的計數值（圖4A）。基于這兩個品種的整個轉錄組圖譜，提出了組織特異性的簇。具體來說，具有相似生理功能的組織更容易聚集在一起。在6個組織中共鑒定出163個PSG中的83個DEG（圖4B）。而其他基因似乎在其他組織或發育階段發揮作用。通過富集分析，作者發現肉雞B品種和BJY雞之間的緊密連接通路和肌凝蛋白功能有顯著差異。這些功能和基因在B品種中明顯占優勢。參與這些功能的基因（MYH1A、MYH1B和MYH1C）主要與肌肉發育有關，尤其是胸肌。此外，作者還檢測到大多數假定選擇的lncRNA不表達，只有9個lncRNA在6個組織中表達，但沒有發現顯著差異。
接著，研究者對163個PSG中的組織特異性基因（TSG）進行分析，在兩個階段分別發現了18個和22個基因（圖4C）。對于這些TSG，超過50%的基因在肌肉組織中高表達，包括TMEM38A和GGA18上的MYH基因家族成員。此外，TPM4、FTCD、DRAM1、TMEM26也分別在心、肝、肺中特異性表達。與組織特異性表達譜一致的是，與BJY雞相比，MYH基因家族中的一些基因（MYH1B、MYH1C、MYH1G）在D1和D42中在B品種的胸肌中高表達（圖4C）。FTCD和BTBD11在肝臟中表達水平較低，并在肉雞中特異性表達（圖4C）。此外，發現COL6A2在腹部脂肪中高表達，但在肝臟中有差異表達。此外，作者還發現SOX6基因在B品種胸肌中的表達高于BJY雞。綜上所述，B品種各器官與BJY雞有明顯差異，可以推斷，在轉錄水平上，肉雞與本地雞種的肌肉存在主要差異。MYH基因家族中的基因（MYH1A、MYH1B、MYH1C等）被確定為調節肌肉發育的功能靶點。隨后，研究者通過加權基因共表達分析網絡（WGCNA）篩選出15620個基因。根據整個轉錄組譜，共收集到20個模塊（圖4D-E），除灰色模塊外，每個模塊包含64-5513個基因。為了獲得組織特異性模塊，以相關系數r＞0.5或r＜-0.5，P＜1.0-10為標準，評價20個模塊與6個組織的相關性。其中鑒定出10個組織特異性模塊（圖4E）。例如，暗藍綠色和綠黃色模塊與胸肌高度相關。根據GO注釋，研究者發現基因在組織特異性模塊中的功能富集與組織功能一致。例如，胸肌特異性模塊中的基因在調節成肌細胞分化和骨骼肌細胞分化以及糖酵解過程和糖異生中富集（圖4F）。白色和黃色模塊對應肝臟，這些模塊中的基因與氧化還原酶活性、氧化還原過程以及脂肪酸代謝有關。此外，根據GS＞0.2和MM＞0.8的標準，近23%參與組織特異性模塊的基因被確定為與這6個組織相關的核心基因。例如，核心基因的一個子集，包括MYH1A、MYH1C和MYH1D，被發現在胸肌中具有高相關性和特異性表達，這強調了MYH基因家族成員在胸肌中的作用。
圖4 純種肉雞B系和地方品種BJY雞推定選擇基因(PSGs)轉錄組圖譜
GWAS與BrW和BrP的精細映射
BrW和BrP都是雞育種的關鍵性狀。純種肉雞B品種經過數代基因組選擇，兩種性狀也發生了顯著變化。因此，研究者使用GWAS方法在B品種中檢測與它們相關的遺傳標記，結果發現位于GGA5上的一個580 kb的區域（10.81-11.39 Mb）顯示出兩個胸肌性狀的顯著峰值（圖5A-B）。根據Q-Q圖中基因組膨脹因子（0.989 ~ 0.992）的計算結果，未發現群體分層現象。BrW和BrP分別有18個和36個SNPs超過提示閾值。對于兩個性狀GWAS結果中領先的SNP，基因型遺傳變異占比分別為13.61%和9.57%。在該區域內，還發現了INSC、SOX6和4個非編碼RNA。隨后，研究者根據B品種與地方雞種和GGS的比較，進行選擇性分析，縮小候選區域（圖5C），結果發現了一個30kb的區域有明顯的選擇性特征。為了驗證這一結果，作者還對3只快速生長純種肉雞、本地雞和GGS進行了相同的分析。在快速生長的純種肉雞中，存在著相似的選擇性特征，即富集雜合度降低，核苷酸多態性降低，群體分化更高，而在本地雞和GGS并非如此。因此，縮小的30 kb區域是一個有效的候選發散區，影響了胸肌性狀。研究者在該區域內共檢測到133個SNP，其中17個SNP與BrW或BrP相關，并確定了三個主要的單倍型（圖5D）。攜帶單倍型II的雞胸肌的表型更為突出。單倍型I和單倍型III之間只有一個堿基不同（圖5D），單倍型I和單倍型III之間沒有表型差異。這種SNP可能不是一個因果變異，沒有進一步考慮。因此，作者分析并確定了兩種主要的單倍型（rHap I和rHap II）（圖5D）。同樣，具有不同單倍型的雞之間也存在顯著的表型差異（圖5E-F）。此外，還確定了其他20個品種的單倍型狀態（圖5G）；僅檢測到速生純種肉雞攜帶單倍型II，其余18個肉雞品種均未發現該單倍型（圖5G）。所有證據表明，單倍型II可能是肌胸肉性狀的遺傳因素。
圖5 純種肉雞B系BrW和BrP的GWAS和精細定位
SOX6基因是BrW和BrP的潛在致病基因
為了確定有效基因，研究者首先對胸肌中的候選基因進行了RT-PCR檢測。從比較結果來看，根據不同的單倍型，只有SOX6在mRNA和蛋白水平上有差異表達（圖6A）。雖然INSC基因沒有差異表達，但這四種lncRNA在胸肌肉樣本中沒有表達。為了最大化挖掘致病基因的可能性，作者檢測了候選區域周圍基因的表達。然而，在兩個精制單倍型樣品之間沒有發現DEG。此外，作者還確定了不同發育階段的表達變化，發現SOX6隨生長發育過程呈上升趨勢，其他基因表達波動較小（圖6B）。因此，SOX6被鑒定為可能影響BrW和BrP的功能基因。為了進一步驗證，研究者首先進行了基于SOX6周圍SNP的cis-eQTL分析。結果發現盡管它們并不有助于縮小區域或單倍型，但是對SOX6表達有顯著影響（圖6C）。接下來，作者通過SMR來估計SOX6對胸肌性狀的影響。SMR共發現14個合格的SNPs，敏感性分析證實不存在異質性（圖6D），且SOX6和胸肌性狀之間的關聯不受任何單個SNP的驅動。然后，SOX6對BrW和BrP均有顯著的正向作用（圖6E），證明了SOX6是影響胸肌性狀的功能基因。雖然已經證實SOX6的表達水平與B品種的BrW和BrP表型之間存在一定的關聯，但還需要在其他品種中驗證這種關聯。研究者比較了當地品種JXY雞、JL雞和純種肉雞B品種的基因表達和表型變化（圖6F-G）。和預期一致，SOX6表達量越低，胸肌尺寸越小，且SOX6表達量與3個品種BrW和BrP呈正相關（圖6G-I）。此外，B品種中SOX6的蛋白水平持續升高，這與mRNA的測量結果一致。GWAS表明SOX6可能是調控木質化雞胸肉（WS）和白條紋雞胸肉（WB）的潛在致病基因。因此，研究者對WB和WS進行評分，并將其與SOX6相關聯，以研究其調控模式。在B品種中，SOX6與WB和WS呈正相關（圖6J-K）。CF和肌病之間的關系已在之前的報告和本研究中得到證實，并發現SOX6對CF性狀有加速作用。此外，胸肌損失也與SOX6相關。因此，研究者發現SOX6對胸肌病和肉質相關性狀具有至關重要的影響。
圖6 SOX6基因在不同類型品種中的表達及表型相關性分析
【小結】
本研究構建了一個包含與肌肉發育相關的多個組織和階段的基因組變異和轉錄組變異的大規模圖譜，為探索肉雞生產性狀的遺傳基礎提供了充分和有價值的信息。根據基因組和轉錄組學證據，胸肌是純種肉雞與當地雞或GGS的主要差異。PSGs、TSGs和DEGs有助于更好地理解不同類型雞的進化差異。SOX6-MYH1s和BrW、BrP及肌病的致病基因SOX6將有助于針對雞的高肉產量進行選擇。
