1. 不同提取方法的提取效率比較分析

通過四種提取方式對比可得。UMAE的產率最高，時間最短（表1），可能是超聲的聲空化和機械切割促進了溶劑的滲透和多糖的溶解，破壞了材料基體。此外，獨特的微波輻射加熱作用可進一步促進多糖的細胞壁深度破裂和擴散。

2. 不同方法提取的生長素的理化性質

四種提取方法的主要化學成分（碳水化合物、硫酸自由基、蛋白質和糖醛酸）無顯著差異（表2）。但CRP-U的平均MW最低，可能會導致CRP的降解（圖1A）。所有CRP樣本單糖類型一致，以葡萄糖為主，甘露糖和半乳糖含量較少，但CRP-H半乳糖含量偏低。相比之下，CRP-M的微波輻照可以通過高溫和內部產生的壓力使組織迅速破壞，從而縮短提取時間，使多糖熱降解的影響最小化。

圖1. 不同方法提取的crp的HPSEC色譜圖

3. 不同方法提取的CRPs的結構特征

如圖1C所示，4個CRP樣品呈現平行的紅外特征曲線，四種提取方法對crp的糖苷鍵構型或主要官能團均無明顯影響。

甲基化結果表明（表3），主鏈結果差異不明顯，而T-Glcp-(1→、→4)- glcp -(1→、→6)- galp -(1→)的相對摩爾百分比差異顯著，這個結果和他們單糖組成的成分分析結果一致。

經分支度（DOB）測定可得（圖3），4個樣品中， CRP-UM的DOB顯著低于其他三種，但其他三個方法引起DOB差異的糖苷鍵的摩爾百分比有所不同。從機理上看，不同的提取方法可以產生不同程度的分支鏈的多糖以及不同的糖苷鍵。

圖3. CRPs 的分支度(A). 不同濃度的NaOH 四種提取方法提取的剛果紅與CRPs混合物的吸光度值。

NMR研究了不同制備方法對CRP的影響（圖4），結果表明CRP-H、CRP-M和CRP-U的13C NMR峰豐度明顯高于CRP-UM，說明crp的糖苷連鎖比例不同。這些結果與上述單糖組成和甲基化分析結果一致。

圖4.四種提取方式的CRP的13C結果圖

4. 不同方法提取的crp的構象和微觀結構

結果如圖3B所示，所有樣品均存在三螺旋構象，但是CRP-UM比其他三種更明顯，說明提取方法對多糖的構象有顯著影響。

電鏡結果可知（圖5A），四種多糖在形狀和大小上存在顯著差異。通過AFM觀察到，所有crp主要表現為球形和不規則的塊體以及分支糖鏈的纏結（圖5BC）。

圖5.四種方法提取的CRP的SEM以及AFM結果

5.CRP反應蛋白的還原能力及清除自由基能力

 測定了FRAP、手性OH、手性O2?和手性ABTS+清除活性來反應不同方法提取的多糖的活性（圖6）。所有的CRP樣本均表現出體外抗氧化活性，其中CRP-UM最強，這可能是因為超聲波和微波協同作用，提高了多糖的提取效率，減少了多糖的降解。

圖6. 四種方法提取的CRPs的還原能力

6. CRP在HL-7702細胞中的抗氧化活性

測定了CRPs其對人肝細胞系HL-7702增殖的影響。結果顯示（圖7），四種提取方法均劑量依賴型的減輕了細胞的損傷，并且如預期一樣的是CRP-UM表現出最有效的活性。而CRP-M對HL-7702細胞的保護作用極為顯著，其余兩種方法效果不明顯，這可能是因為熱水以及超聲提取破壞了CRP固有的結構特征，從而犧牲了其抗氧化活性。

圖7. 四種方法提取的CRPs的抗氧化活性可以改變h2o2誘導的HL-7702細胞氧化損傷。

7. CRP在RAW264.7細胞中的免疫刺激活性

比較了不同CRP樣本激活RAW 264.7細胞的能力(圖8)。當CRP濃度超過25 μg/mL時，各CRP處理組間的差異顯著。并且多糖的活性是多種結構特征共同作用的結果。例如，CRP-H免疫活性最強而抗氧化活性最低，但CRP-UM與之相反。這可能是因為水體過程中的加熱使得CRP-H具有較高的分支，溫和的分子量以及適度的三螺旋結構，從而提高了CRP與巨噬細胞之間的親和力。同樣，CRP-M相對較大的粒徑和柔性鏈也有助于提高其免疫刺激活性。CRP- m具有較高的產率、抗氧化和免疫刺激能力，表明MAE可以作為一種合適的CRP提取方法。

圖8. 四種方法提取的crp對RWA264.7細胞增殖(A)、ROS水平(B)、NO (C)、TNF-α (D)含量的影響。