草莓中的酚類物質(zhì)使其具有強抗氧化作用，然而由于檢測和分析技術的限制，對草莓酚類物質(zhì)的分析尚不完整，阻礙了對其作用機制的更深入理解。本研究采用雙相萃取法提取草莓中的游離酚和結(jié)合酚，然后采用基于UHPLC-QTOF-MS的非靶向代謝組學方法，共注釋了57種酚類物質(zhì)，其中12種通過標準品進一步鑒定。

草莓[平房（PF）、雙城（SC）、丹東（DD）和黑河（HH）]

非靶代謝組學技術、DPPH自由基清除試驗、靶向代謝組學技術、網(wǎng)絡藥理學分析、分子對接

作者對來自中國東北四個主要產(chǎn)地（PF、SC、DD、HH）的‘紅顏’草莓進行了分析，總酚含量與抗氧化能力的測定結(jié)果如圖A1所示。DD（丹東）和HH（黑河）產(chǎn)地的草莓總酚含量顯著高于PF（平房）和SC（雙城）產(chǎn)地，具體范圍為57.57至63.45 mg GAE/100 g FW，而后兩者為52.76至56.78 mg GAE/100 g FW。這一趨勢表明產(chǎn)地差異對草莓中酚類物質(zhì)的積累具有顯著影響。

圖1  草莓酚類化合物提取和鑒定

作者利用UHPLC-QTOF-MS技術對草莓中的酚類化合物進行了全面注釋與鑒定。通過高分辨率的質(zhì)譜分析，共注釋了57種酚類化合物，其中12種通過與商業(yè)標準品對照得以確證，包括原花青素B1和B2、tiliroside、對香豆酸、山奈酚、表兒茶素、阿魏酸、木犀草素、蘋果素、槲皮苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷以及矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷（圖1B）。這些確證的化合物大多屬于黃酮類與低分子酚酸類，具有較高的生物活性和良好的吸收利用潛力。尤其值得注意的是，在注釋的57種酚類中，有26種是首次在草莓可食部分中被報道，這些化合物主要為黃酮類物質(zhì)，豐富了人們對草莓酚類譜系的認識。為進一步揭示這些酚類之間的結(jié)構(gòu)關聯(lián)性，作者構(gòu)建了圖1B所示的分子網(wǎng)絡圖。

作者對草莓中12種通過標準品確證的代表性酚類化合物進行了定量分析，分別測定了它們在四個產(chǎn)地（PF、DD、HH、SC）草莓樣品中的游離態(tài)（F）、結(jié)合態(tài)（B）及總量（T，F(xiàn)+B），并整理于表1中。從酚類的存在形態(tài)來看，大多數(shù)化合物以游離態(tài)為主，如原花青素B1和B2、tiliroside、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚等，說明這些物質(zhì)在草莓組織中較易被釋放與吸收。在具體含量方面，矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷（pelargonidin-3-O-glucoside）是最豐富的酚類，是決定草莓紅色色澤的主要花青素成分；其次是原花青素B1和B2，具有較強的抗氧化、降糖、抗炎等功能；tiliroside作為一種黃酮類苷類，在HH樣品中含量最高（120.44 mg/kg DW），具備調(diào)脂、抗肥胖等潛在健康作用。

表1 酚類物質(zhì)的定量結(jié)果

作者通過多種統(tǒng)計學方法對草莓中酚類化合物的差異性及其來源關聯(lián)性進行了系統(tǒng)分析。圖2A展示了KEGG通路富集分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所識別的酚類成分在“黃酮類生物合成”和“植物次級代謝產(chǎn)物合成”通路中顯著富集。進一步地，研究通過主成分分析（PCA）所示（圖2B-D）四個產(chǎn)地樣本在酚類組成上具有明顯區(qū)分性，特別是丹東（DD）和黑河（HH）樣本與平房（PF）和雙城（SC）樣本在主成分空間中分布明顯不同，說明產(chǎn)地對草莓酚類組分的影響顯著，進一步分析這種差異性，顯示DD和HH的游離酚類差異最大，而四地草莓在結(jié)合態(tài)酚類方面差異不顯著。層次聚類分析（HCA）探討了不同產(chǎn)地草莓中酚類化合物的整體分布差異（圖2E–G），游離酚類的聚類圖清晰地將樣本按產(chǎn)地歸類，表明游離酚類的組成高度受產(chǎn)地影響。例如，某些具有代表性的酚類物質(zhì)如[6]-姜辣素、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、香豆素醇、1,4-二羥基蒽醌、山奈酚和芍藥素等在特定產(chǎn)地中富集，因而可作為產(chǎn)地判別的潛在生物標志物。而結(jié)合態(tài)酚類的聚類圖則顯示樣本間歸類較為混亂，提示結(jié)合態(tài)酚類不具明顯地域特異性。圖2H展示了酚類化合物與抗氧化活性指標（總酚含量、DPPH清除能力、FRAP還原力）之間的Spearman相關性熱圖。大多數(shù)酚類與抗氧化性呈正相關，進一步驗證其體外抗氧化能力。但不同酚類與不同抗氧化指標的相關性程度不一，反映出其抗氧化機制可能具有多樣性和特異性。

圖2 酚類物質(zhì)多元統(tǒng)計分析

作者運用網(wǎng)絡藥理學方法，系統(tǒng)探究了草莓中酚類化合物對人體氧化應激相關疾病的潛在作用靶點，并構(gòu)建了“酚類-靶點-疾病”網(wǎng)絡，以揭示其可能的抗氧化機制。首先，通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預測了草莓中已注釋與確證的酚類化合物的潛在靶點，共識別出535個候選靶點。同時，他們還從GeneCards、OMIM、PharmGKB和TTD等四個數(shù)據(jù)庫中篩選出與氧化應激驅(qū)動疾病相關的1555個靶點。兩者交集得到236個潛在靶點，這些靶點可能是草莓酚類在人體中發(fā)揮抗氧化作用的關鍵節(jié)點（圖3A-B）。

作者構(gòu)建了酚類與靶點之間的網(wǎng)絡圖（圖3C），揭示了一個“多成分-多靶點-多路徑”的復雜交互系統(tǒng)。這種網(wǎng)絡特性表明，草莓酚類不是通過單一作用點起效，而是以多種活性成分協(xié)同調(diào)控多個靶點，從而影響多種生理路徑，與傳統(tǒng)的“單靶點-單藥物”模式形成鮮明對比。進一步的GO與KEGG富集分析結(jié)果（圖3D–E）顯示，這些236個靶點主要富集在調(diào)控細胞磷酸化、應激反應、細胞信號轉(zhuǎn)導等生物過程中，尤其是在PI3K-AKT信號通路中，該通路在調(diào)控細胞生長、生存與抗凋亡方面發(fā)揮核心作用，并與癌癥、炎癥等氧化應激相關疾病密切相關。

最后，通過構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡（PPI），并結(jié)合拓撲學參數(shù)（如度中心性DC、介數(shù)中心性BC等）篩選出21個核心靶點（圖3F），其中包括SRC、PIK3CA、PIK3R1、HSP90AA1和TP53等關鍵基因。這些核心靶點在PI3K-AKT通路中分別處于上游激活、中樞信號轉(zhuǎn)導和下游調(diào)控的位置，是酚類化合物發(fā)揮系統(tǒng)抗氧化作用的關鍵。

圖3 酚類代謝物網(wǎng)絡藥理學分析

作者基于前期網(wǎng)絡藥理學篩選出的關鍵靶點（SRC、PIK3CA、PIK3R1、HSP90AA1、TP53），進一步開展分子對接實驗，系統(tǒng)探討草莓酚類通過PI3K-AKT信號通路調(diào)節(jié)氧化應激—疾病軸的分子機制。通過SwissADME預測分析，研究篩選出一批具有良好生物利用度的酚類，如chrysophanic acid、luteolin、coumesterol 和 chrysin-7-O-β-gentiobioside等，并對它們與上述靶蛋白進行了對接模擬。對接結(jié)果顯示，這些酚類與目標蛋白之間普遍具有較強的結(jié)合能力（表2中結(jié)合能多低于?7 kcal/mol），提示其在天然形式下可能有效調(diào)控氧化應激相關信號通路。

表2 草莓酚類物質(zhì)與PI3K-AKT信號通路的關鍵調(diào)節(jié)因子（SRC、PI3K、HSP90α和p53）之間的結(jié)合能

圖4B進一步展示了幾種代表性酚類的結(jié)合位點及相互作用模式。例如，chrysophanic acid 可與SRC蛋白的激酶活性中心形成穩(wěn)定氫鍵（Thr338、Glu339、Met341），可能阻斷其激活PI3K的能力，間接抑制下游AKT的激活過程；同時該化合物還能結(jié)合PI3K的p110α亞基關鍵位點（Val851、Tyr836），進一步干擾信號傳遞。Luteolin則靶向p85α亞基的SH2結(jié)構(gòu)域，可能削弱其與磷酸化受體的結(jié)合能力，從源頭阻斷PI3K活化。此外，coumesterol能夠結(jié)合HSP90α的ATP結(jié)合口袋（Leu107），干擾其對AKT與突變型p53的穩(wěn)定功能，從而抑制異常信號維持。而chrysin-7-O-β-gentiobioside可穩(wěn)定p53二聚體結(jié)構(gòu)，有助于維持其DNA修復與抗凋亡功能。

圖4 酚類物質(zhì)分子對接

從上述文章不難發(fā)現(xiàn)，如何在代謝物鑒定中兼顧樣本高復雜度和物質(zhì)含量低豐度，是提升植物代謝研究的關鍵。

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