蛋白質(zhì)磷酸化修飾在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中有重要作用，是細(xì)胞凋亡、炎癥、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等多種功能的重要翻譯后修飾調(diào)控方式。目前，磷酸化蛋白的富集技術(shù)已經(jīng)得到了重大進(jìn)展，但目前磷酸化蛋白的定性和定量檢測(cè)在準(zhǔn)確度、精確度和通量上還有很大的挑戰(zhàn)。
293T細(xì)胞、小鼠組織
Orbitrap Astral DIA
為了測(cè)試Orbitrap Astral質(zhì)譜分析磷酸肽的性能，作者從HEK239T細(xì)胞中富集了色氨酸磷酸肽段，使用Orbitrap Astral質(zhì)譜儀（圖1A）數(shù)據(jù)依賴采集(DDA)方法進(jìn)行檢測(cè)。圖1B展示了其中一個(gè)肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖?？偟膩?lái)說(shuō)，30分鐘的nLC-MS/MS DDA共檢測(cè)了12,327個(gè)磷酸化肽段，對(duì)應(yīng)于9,537個(gè)磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)分辨率(圖1C)和質(zhì)量精度(圖1D)來(lái)研究Astral分析儀的能力，Astral的分辨能力隨著m/z值的增加而持續(xù)，且在95%的離子質(zhì)量精度在5ppm以內(nèi)。
作者又使用30分鐘的DIA方法（圖2A）分析了250ng色氨酸磷酸肽段，得到29,190個(gè)磷酸化位點(diǎn)，隨后作者又測(cè)試了4m/z的窗口、1ug-50ng的上樣量、7-30分鐘的液相梯度（圖2B-F），不同的處理帶來(lái)不同的檢測(cè)結(jié)果，總而言之窗口越小、上樣量越大，時(shí)間越長(zhǎng)，得到的磷酸化位點(diǎn)結(jié)果越多，準(zhǔn)確度越高。
為了說(shuō)明數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，作者使用人類和玉米的整合數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，及對(duì)標(biāo)準(zhǔn)肽段進(jìn)行重分析，F(xiàn)DR值及對(duì)于其他位點(diǎn)磷酸化的分析都證明了數(shù)據(jù)的可靠性。
圖1 Orbitrap Astral技術(shù)原理和高精度檢測(cè)
圖2 Orbitrap Astral檢測(cè)293T細(xì)胞磷酸化
作者使用EGF處理和對(duì)照的HEK239T細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)平臺(tái)的比較，Orbitrap Astral比timsTOF pro多鑒定到了3倍的磷酸化位點(diǎn)（圖3A），可以看到Orbitrap Astral對(duì)于低豐度的磷酸化肽段檢測(cè)效果更好，有更寬的動(dòng)態(tài)范圍、更好的重復(fù)性（圖B-E）。通過(guò)對(duì)照和處理組的差異比較和通路分析結(jié)果，雖然鑒定的數(shù)量各不相同，但差異都同時(shí)指向EGF相關(guān)通路（圖3F、G）。
圖3 Orbitrap Astral與timsTOF pro技術(shù)對(duì)比
證明了Orbitrap Astral的快速和高靈敏度后，作者計(jì)劃完成一個(gè)小鼠磷酸化位點(diǎn)完整圖譜。之前的研究是10天的檢測(cè)時(shí)間鑒定到35,965個(gè)磷酸化位點(diǎn)，作者本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（圖4A），收集了小鼠12個(gè)不同組織，每個(gè)組織分4個(gè)組分，每個(gè)組分檢測(cè)15min，整個(gè)實(shí)驗(yàn)共計(jì)12小時(shí)完成檢測(cè)，共鑒定到81,120個(gè)磷酸化位點(diǎn)，不同組織的位點(diǎn)從20,000到40,000不等，且磷酸化位點(diǎn)的分布具有組織特異性。（圖4B-E）。
圖4 Orbitrap Astral檢測(cè)小鼠組織磷酸化蛋白質(zhì)組
4. 磷酸化位點(diǎn)在蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)中的作用及激酶分析
磷酸化位點(diǎn)在蛋白質(zhì)的序列的結(jié)構(gòu)上有重要作用，作者對(duì)磷酸化位點(diǎn)上下游5個(gè)氨基酸進(jìn)行的基序分析，得到了主要的基序序列，比如S/T-P等等（圖5A、B）。為了研究這些基序的結(jié)構(gòu)特征，作者使用AlphaFold對(duì)81,120個(gè)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)置信評(píng)分，大部分位點(diǎn)都處于低分區(qū)段，說(shuō)明大部分位點(diǎn)都在蛋白的無(wú)序結(jié)構(gòu)（圖5C）。
作者使用預(yù)測(cè)軟件，利用合成肽庫(kù)分析底物序列的特異性（圖5D），結(jié)果表明一半以上的磷酸化位點(diǎn)被24種/更多的激酶靶向，且不同組織的磷酸化激酶位點(diǎn)具有組織特異性，比如腦部的磷酸化與神經(jīng)性疾病狀態(tài)相關(guān)（圖5E-G）。
圖5 小鼠磷酸化位點(diǎn)基序分析和激酶分析
5. 線粒體蛋白的新磷酸化位點(diǎn)
作者為了深入分析，對(duì)81,120個(gè)磷酸化位點(diǎn)數(shù)據(jù)與phosphositeplus52的小鼠磷酸化位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)了38,454個(gè)新位點(diǎn)，占總位點(diǎn)的53%（圖6A），其中線粒體蛋白相關(guān)的磷酸化位點(diǎn)最具代表性（圖6B、C），且線粒體蛋白的磷酸化具有組織特異性，在肝臟中最表現(xiàn)最突出（圖6D）。其中，CPS1的磷酸化位點(diǎn)最多，共40個(gè)（圖6E），其中22個(gè)之前沒有報(bào)道過(guò)（圖6F），且不同的位點(diǎn)對(duì)應(yīng)不同的功能和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（圖6G、H）。
圖6 小鼠組織新磷酸化位點(diǎn)
6. 腦組織磷酸化位點(diǎn)水平動(dòng)態(tài)范圍最大
進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析表明，腦部組織的磷酸化特異性位點(diǎn)最多（圖7A），根據(jù)Z-score，腦部有9,541個(gè)磷酸化位點(diǎn)異常值（圖7B），根據(jù)排名確定視神經(jīng)萎縮蛋白1（OPA1）的S298磷酸化位點(diǎn)最重要（圖7C）。對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行基序和結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)一步說(shuō)明該位點(diǎn)對(duì)OPA1功能的重要性（圖7D-F）。
圖7 小鼠腦組織磷酸化分析
由于其在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，蛋白質(zhì)磷酸化在無(wú)數(shù)細(xì)胞過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。本研究使用新型質(zhì)譜儀（Orbitrap Astral）結(jié)合數(shù)據(jù)獨(dú)立采集（DIA）來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)人類和小鼠磷酸化蛋白質(zhì)組的快速和深入分析。通過(guò)這種方法，半小時(shí)內(nèi)繪制了大約30,000個(gè)獨(dú)特的人類磷酸化位點(diǎn)。應(yīng)用這種方法生成了小鼠的磷酸蛋白質(zhì)組多組織圖譜。在12小時(shí)內(nèi)，總共檢測(cè)到81,120個(gè)獨(dú)特的磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)這個(gè)獨(dú)特的數(shù)據(jù)集，作者研究了蛋白質(zhì)磷酸化的序列、結(jié)構(gòu)和激酶特異性背景。最后，通過(guò)與線粒體和腦生物學(xué)相關(guān)的新型磷酸化事件的多個(gè)例子強(qiáng)調(diào)了這一資源的發(fā)現(xiàn)潛力。
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排版：野凌
審核：三黍生物企宣部
