蛋白質磷酸化修飾在細胞信號轉導中有重要作用，是細胞凋亡、炎癥、蛋白轉運等多種功能的重要翻譯后修飾調控方式。目前，磷酸化蛋白的富集技術已經得到了重大進展，但目前磷酸化蛋白的定性和定量檢測在準確度、精確度和通量上還有很大的挑戰。
293T細胞、小鼠組織
Orbitrap Astral DIA
為了測試Orbitrap Astral質譜分析磷酸肽的性能，作者從HEK239T細胞中富集了色氨酸磷酸肽段，使用Orbitrap Astral質譜儀（圖1A）數據依賴采集(DDA)方法進行檢測。圖1B展示了其中一個肽段的二級質譜圖。總的來說，30分鐘的nLC-MS/MS DDA共檢測了12,327個磷酸化肽段，對應于9,537個磷酸化位點。通過分辨率(圖1C)和質量精度(圖1D)來研究Astral分析儀的能力，Astral的分辨能力隨著m/z值的增加而持續，且在95%的離子質量精度在5ppm以內。
作者又使用30分鐘的DIA方法（圖2A）分析了250ng色氨酸磷酸肽段，得到29,190個磷酸化位點，隨后作者又測試了4m/z的窗口、1ug-50ng的上樣量、7-30分鐘的液相梯度（圖2B-F），不同的處理帶來不同的檢測結果，總而言之窗口越小、上樣量越大，時間越長，得到的磷酸化位點結果越多，準確度越高。
為了說明數據的準確性，作者使用人類和玉米的整合數據庫對上述數據進行分析，及對標準肽段進行重分析，FDR值及對于其他位點磷酸化的分析都證明了數據的可靠性。
圖1 Orbitrap Astral技術原理和高精度檢測
圖2 Orbitrap Astral檢測293T細胞磷酸化
作者使用EGF處理和對照的HEK239T細胞進行了檢測平臺的比較，Orbitrap Astral比timsTOF pro多鑒定到了3倍的磷酸化位點（圖3A），可以看到Orbitrap Astral對于低豐度的磷酸化肽段檢測效果更好，有更寬的動態范圍、更好的重復性（圖B-E）。通過對照和處理組的差異比較和通路分析結果，雖然鑒定的數量各不相同，但差異都同時指向EGF相關通路（圖3F、G）。
圖3 Orbitrap Astral與timsTOF pro技術對比
證明了Orbitrap Astral的快速和高靈敏度后，作者計劃完成一個小鼠磷酸化位點完整圖譜。之前的研究是10天的檢測時間鑒定到35,965個磷酸化位點，作者本次實驗設計（圖4A），收集了小鼠12個不同組織，每個組織分4個組分，每個組分檢測15min，整個實驗共計12小時完成檢測，共鑒定到81,120個磷酸化位點，不同組織的位點從20,000到40,000不等，且磷酸化位點的分布具有組織特異性。（圖4B-E）。
圖4 Orbitrap Astral檢測小鼠組織磷酸化蛋白質組
4. 磷酸化位點在蛋白質序列和結構中的作用及激酶分析
磷酸化位點在蛋白質的序列的結構上有重要作用，作者對磷酸化位點上下游5個氨基酸進行的基序分析，得到了主要的基序序列，比如S/T-P等等（圖5A、B）。為了研究這些基序的結構特征，作者使用AlphaFold對81,120個磷酸化位點進行預測，根據置信評分，大部分位點都處于低分區段，說明大部分位點都在蛋白的無序結構（圖5C）。
作者使用預測軟件，利用合成肽庫分析底物序列的特異性（圖5D），結果表明一半以上的磷酸化位點被24種/更多的激酶靶向，且不同組織的磷酸化激酶位點具有組織特異性，比如腦部的磷酸化與神經性疾病狀態相關（圖5E-G）。
圖5 小鼠磷酸化位點基序分析和激酶分析
5. 線粒體蛋白的新磷酸化位點
作者為了深入分析，對81,120個磷酸化位點數據與phosphositeplus52的小鼠磷酸化位點數據進行了比較，發現了38,454個新位點，占總位點的53%（圖6A），其中線粒體蛋白相關的磷酸化位點最具代表性（圖6B、C），且線粒體蛋白的磷酸化具有組織特異性，在肝臟中最表現最突出（圖6D）。其中，CPS1的磷酸化位點最多，共40個（圖6E），其中22個之前沒有報道過（圖6F），且不同的位點對應不同的功能和結構特點（圖6G、H）。
圖6 小鼠組織新磷酸化位點
6. 腦組織磷酸化位點水平動態范圍最大
進一步數據分析表明，腦部組織的磷酸化特異性位點最多（圖7A），根據Z-score，腦部有9,541個磷酸化位點異常值（圖7B），根據排名確定視神經萎縮蛋白1（OPA1）的S298磷酸化位點最重要（圖7C）。對該位點進行基序和結構分析，進一步說明該位點對OPA1功能的重要性（圖7D-F）。
圖7 小鼠腦組織磷酸化分析
由于其在細胞信號轉導中的作用，蛋白質磷酸化在無數細胞過程中起著至關重要的作用。本研究使用新型質譜儀（Orbitrap Astral）結合數據獨立采集（DIA）來實現對人類和小鼠磷酸化蛋白質組的快速和深入分析。通過這種方法，半小時內繪制了大約30,000個獨特的人類磷酸化位點。應用這種方法生成了小鼠的磷酸蛋白質組多組織圖譜。在12小時內，總共檢測到81,120個獨特的磷酸化位點。通過這個獨特的數據集，作者研究了蛋白質磷酸化的序列、結構和激酶特異性背景。最后，通過與線粒體和腦生物學相關的新型磷酸化事件的多個例子強調了這一資源的發現潛力。
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排版：野凌
審核：三黍生物企宣部
