人參在中國歷史上一直被用作補氣藥，可增強機體對非特異性損傷和疲勞的抵抗力。多糖占人參成分的 4-6%，被認為是干根中最突出的免疫增強成分之一。最近的研究報告了人參多糖的分離和特征，這些多糖具有顯著的抗氧化作用和抗輻射作用。在之前的一項研究中，從人參中分離出的一種酸多糖（GSPA）能顯著提高甲型 H1N1 流感疫苗免疫小鼠的中和抗體水平，其功效優于作為佐劑的明礬。
2024年2月，沈陽藥科大學中藥學院翟健秀\殷軍教授團隊在Carbohydrate Polymers發表題目為“Structural analysis of a soluble polysaccharide GSPA-0.3 from the root of Panax ginseng C. A. Meyer and its adjuvant activity with mechanism investigation”的研究論文，從培養的人參根中分離純化了一種新的多糖（GSPA-0.3），并通過分子量、單糖組成、甲基化、核磁共振和質譜分析，闡明了GSPA-0.3的結構及其單糖組成。利用DC2.4細胞對GSPA-0.3 的 H1N1 疫苗佐劑活性和安全性進行了進一步的體外評估，同時在 H1N1免疫小鼠體內對其佐劑活性進行了評估，證實了GSPA-0.3可能通過TLR4-MyD88-NF-κb信號通路調節Th1/Th2應答，從而顯著提高H1N1疫苗的療效。
人參多糖、C57BL/6小鼠、DC2.4 細胞
分子量分析、單糖組成分析、紅外光譜分析、紫外-可見光譜分析、甲基化分析、核磁共振分析、掃描電鏡分析、原子力顯微鏡分析、剛果紅檢測、免疫小鼠模型、RT-PCR、ELISA、細胞實驗
1. GSPA-0.3的提取與純化
從人參中提取并純化得到GSPA-0.3。提取過程包括熱水提取、乙醇沉淀和凍干處理，隨后通過離子交換柱層析和Sepharcyl S200 HR柱層析進一步純化。GSPA-0.3的總碳水化合物含量高達91.5%，且醛酸含量占36.6%。
圖1 GSPA-0.3純化示意圖
圖2 從人參根中分離純化GSPA-0.3。(A)粗多糖在DEAE-52柱層析上的洗脫剖面。(B) GSPA-0.3在Sephacryl S-200 HR柱層析上的洗脫曲線
2. GSPA-0.3的化學特性
GSPA-0.3的紫外-可見光譜分析顯示，該多糖在260 nm和280 nm處沒有吸收，說明其中不含蛋白質和核酸。FT-IR光譜揭示了GSPA-0.3中典型的糖類特征，包括O-H拉伸振動、C-H拉伸和彎曲振動，以及吡喃糖環的C-O彎曲振動。這些結果證實了GSPA-0.3是一種具有復雜結構的酸性多糖。
圖3 GSPA-0.3的UV光譜(A)和FT-IR光譜(B)
3. 分子量和單糖組成分析
通過HPGPC和HPSECMALLS-RI分析，GSPA-0.3的相對分子量和絕對分子量分別為63,350 Da和62,722 Da，顯示出較高的分子量均勻性。單糖組成分析表明，GSPA-0.3主要由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖和半乳糖醛酸組成，其中半乳糖醛酸的比例最高。
圖4 (A) HPGPC光譜;(B) GSPA-0.3的摩爾質量分布色譜圖;(C-D)標準樣品和GSPA-0.3的單糖組成譜
4. 鍵合結構分析
采用甲基化和GC-MS分析揭示了GSPA-0.3中糖殘基的鍵合結構，包括11種不同類型的鍵。其中，4-Gal(p)-UA（半乳糖醛酸的4位連接）占據最大比例，表明它是GSPA-0.3的主要骨架結構。此外，該分析還確認了GSPA-0.3中各種糖殘基的相對比例，與單糖組成數據相近。
5. 核磁共振分析
通過一維和二維核磁共振分析，GSPA-0.3的結構得到了深入解析。在核磁共振波譜中，特定的化學位移（δ值）揭示了GSPA-0.3的糖殘基構型和連接模式。δ 4.3-5.5 ppm范圍內的1H和δ 92-110 ppm范圍內的13C信號確認了α-和β-構型的存在。δ 170 ppm附近的信號則證明了糖醛酸的存在，這與之前的單糖組成分析一致。結構分析顯示，GSPA-0.3的主骨架由[→3)-α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA-(1→3,4)-α-D-GalpA-(1→]的重復單元組成。此外，分支結構包括[α-L-Araf-(1→3,5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→)]、[α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→)]、[β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→)]和α-D-GalpA-(1→)單位，這些單位直接連接在主骨架的特定位置上。
表1 GSPA-0.3甲基化結果(%)
圖5 GSPA-0.3的(A)1H NMR、(B)13C NMR、(C)DEPT-135、(D)COSY、(E)HSQC、(F)HMBC、(G)NOESY、(H)HSQC- TOCSY譜
表2 GSPA-0.3的化學位移
圖6 (A) GSPA-0.3的結構;(B) GSPA-0.3的結構公式
6. 掃描電鏡和原子力顯微鏡分析
GSPA-0.3通過掃描電鏡(SEM)和原子力顯微鏡(AFM)觀察，呈現出不對稱的片狀結構裂紋，顯示其非晶結構特性。AFM圖像揭示了GSPA-0.3的微觀結構中存在多個島狀結構，大小在4.2 nm至6.6 nm之間。這些特征表明GSPA-0.3的聚集結構可能是由分子鏈的相互纏繞以及分子間和分子內氫鍵的相互作用形成的。
7. 三螺旋結構分析
通過剛果紅法檢測，GSPA-0.3在增加NaOH濃度的過程中，其剛果紅多糖復合物的最大吸收波長(λmax)變化不顯著，表明GSPA-0.3不存在典型的三螺旋結構。這一發現提供了關于GSPA-0.3結構特性的重要信息，對于理解其生物活性和潛在應用具有意義。
8. 熱性質研究
通過熱重法(TG-DTG)和差示掃描量熱法(DSC)對GSPA-0.3的熱性質進行了評估。在30°C至800°C的溫度范圍內，GSPA-0.3經歷了三個顯著的質量損失階段，分別歸因于水分蒸發、多糖結構解聚和有機物氧化分解。DSC分析顯示，GSPA-0.3在第一次加熱循環中表現出無定形性質的不穩定性，而在冷卻和第二次加熱循環中則顯示出可能的結晶趨勢。這些熱性質數據為GSPA-0.3的穩定性和加工應用提供了重要參考。
圖7 GSPA-0.3的SEM (A-C)和AFM (D-E)
圖8 (A) TG-DTG曲線，(B)第一個升溫DSC曲線，(C)冷卻DSC曲線，(D)第二個升溫DSC曲線(升溫速率10℃/min, N2環境)
9. 體內實驗結果
通過CCK-8法檢測，GSPA-0.3顯著促進了脾細胞的活力和增殖，且這種促進作用呈劑量依賴性。與H1N1組和明礬組相比，GSPA-0.3顯示出更高的促增殖活性。在免疫小鼠中，GSPA-0.3顯著提高了IgG、IgG1、IgG2a水平及IgG2a/IgG1比值，表明其增強了特異性抗體水平和體液免疫反應。此外，高劑量GSPA-0.3更有效地提高了中和抗體水平。
圖9 (A) GSPA-0.3對脾細胞活力的影響。(B-D) GSPA-0.3與H1N1疫苗、Con A和LPS共孵育時對小鼠脾細胞增殖的影響
圖10 GSPA-0.3對小鼠h1n1特異性抗體水平的影響
圖11 小鼠h1n1特異性中和抗體水平
流式細胞術分析顯示，GSPA-0.3顯著提高了免疫小鼠CD3+/CD4+和CD3+/CD8+比值，表明GSPA-0.3對T細胞亞群有積極影響，且效果優于明礬佐劑。RT-PCR和ELISpot分析表明，GSPA-0.3顯著提高了T-bet、GATA-3、IFN-γ和IL-4等促炎細胞因子編碼基因的表達水平，促進了Th1和Th2細胞產生的細胞因子表達，呈劑量依賴性。
圖12 取免疫小鼠脾細胞，用CD3+/CD4+/CD8+抗體染色
圖13 RT-PCR檢測T-bet (A)、GATA-3 (B)、IFN-γ (C)、IL-4 (D) mRNA轉錄水平
組織學觀察顯示，GSPA-0.3增強了免疫小鼠脾臟白髓生發中心和邊緣帶淋巴細胞數量，脾小體體積也增大，這些變化提示GSPA-0.3增強了免疫小鼠對H1N1疫苗的免疫應答。
圖14 GSPA-0.3對免疫小鼠IFN-γ和IL-4水平的影響
圖15 小鼠脾臟HE染色
10. 體外實驗結果
在24小時內，GSPA-0.3顯著增強DC2.4細胞活力，但高劑量在48小時后對細胞具有毒性。GSPA-0.3通過增加CD11c+/CD80+、CD11c+/CD86+和CD11c+/MHCII的表達來促進DC2.4細胞的成熟，但高劑量（400 μg/mL）的影響略有減弱。GSPA-0.3促進了DC2.4細胞對FITC-OVA抗原的攝取，顯示其作為免疫佐劑的潛力。
圖16 GSPA-0.3對DC2.4細胞作用24 h (A)和48 h (B)的影響
GSPA-0.3顯著上調DC2.4細胞中TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB mRNA的轉錄水平，表明GSPA-0.3能夠激活DC2.4細胞并促進TLR4-MyD88-NF-κB信號通路的活性。
圖17 GSPA-0.3對DC2.4細胞成熟的影響(A-D)
圖18 GSPA-0.3增強DC2.4細胞的抗原攝取
圖19 GSPA-0.3上調DC2.4細胞中TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB mRNA轉錄水平
通過Western blot分析，GSPA-0.3顯著提高了DC2.4細胞細胞核中NF-κB、MyD88、TRAF-6和TLR4蛋白的表達水平，進一步驗證了GSPA-0.3激活TLR4-MyD88-NF-κB信號通路的作用。
圖20 GSPA-0.3上調DC2.4細胞核中TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB的表達水平
該研究從人參根中分離到一種新的酸性多糖(GSPA-0.3, Mw: 62,722 Da)，并確定其結構主要由半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和鼠李糖組成，其中有甘露糖和木糖。GSPA-0.3是一種獨特的高支鏈多糖，其主鏈由→4)-α-D-galpa-(1→，→3)-α-L-rhap-(1→，和→3,4)-α-D-galpa-(1→組成，與其他已報道的多糖不同。GSPA-0.3的分支程度與其活性有關。這種獨特的結構可能是其佐劑活性的基礎，因為在人參根中沒有發現其他部分具有類似的活性。本文首先通過廣泛篩選發現GPSA-0.3的佐劑活性超過Al佐劑。總的來說，本研究的結果強調了GSPA-0.3作為H1N1疫苗有希望的輔助候選物的潛力。
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排版：野凌
審核：三黍生物企宣部
