人參在中國歷史上一直被用作補(bǔ)氣藥，可增強(qiáng)機(jī)體對非特異性損傷和疲勞的抵抗力。多糖占人參成分的 4-6%，被認(rèn)為是干根中最突出的免疫增強(qiáng)成分之一。最近的研究報(bào)告了人參多糖的分離和特征，這些多糖具有顯著的抗氧化作用和抗輻射作用。在之前的一項(xiàng)研究中，從人參中分離出的一種酸多糖（GSPA）能顯著提高甲型 H1N1 流感疫苗免疫小鼠的中和抗體水平，其功效優(yōu)于作為佐劑的明礬。
2024年2月，沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院翟健秀\殷軍教授團(tuán)隊(duì)在Carbohydrate Polymers發(fā)表題目為“Structural analysis of a soluble polysaccharide GSPA-0.3 from the root of Panax ginseng C. A. Meyer and its adjuvant activity with mechanism investigation”的研究論文，從培養(yǎng)的人參根中分離純化了一種新的多糖（GSPA-0.3），并通過分子量、單糖組成、甲基化、核磁共振和質(zhì)譜分析，闡明了GSPA-0.3的結(jié)構(gòu)及其單糖組成。利用DC2.4細(xì)胞對GSPA-0.3 的 H1N1 疫苗佐劑活性和安全性進(jìn)行了進(jìn)一步的體外評估，同時(shí)在 H1N1免疫小鼠體內(nèi)對其佐劑活性進(jìn)行了評估，證實(shí)了GSPA-0.3可能通過TLR4-MyD88-NF-κb信號通路調(diào)節(jié)Th1/Th2應(yīng)答，從而顯著提高H1N1疫苗的療效。
人參多糖、C57BL/6小鼠、DC2.4 細(xì)胞
分子量分析、單糖組成分析、紅外光譜分析、紫外-可見光譜分析、甲基化分析、核磁共振分析、掃描電鏡分析、原子力顯微鏡分析、剛果紅檢測、免疫小鼠模型、RT-PCR、ELISA、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
1. GSPA-0.3的提取與純化
從人參中提取并純化得到GSPA-0.3。提取過程包括熱水提取、乙醇沉淀和凍干處理，隨后通過離子交換柱層析和Sepharcyl S200 HR柱層析進(jìn)一步純化。GSPA-0.3的總碳水化合物含量高達(dá)91.5%，且醛酸含量占36.6%。
圖1 GSPA-0.3純化示意圖
圖2 從人參根中分離純化GSPA-0.3。(A)粗多糖在DEAE-52柱層析上的洗脫剖面。(B) GSPA-0.3在Sephacryl S-200 HR柱層析上的洗脫曲線
2. GSPA-0.3的化學(xué)特性
GSPA-0.3的紫外-可見光譜分析顯示，該多糖在260 nm和280 nm處沒有吸收，說明其中不含蛋白質(zhì)和核酸。FT-IR光譜揭示了GSPA-0.3中典型的糖類特征，包括O-H拉伸振動(dòng)、C-H拉伸和彎曲振動(dòng)，以及吡喃糖環(huán)的C-O彎曲振動(dòng)。這些結(jié)果證實(shí)了GSPA-0.3是一種具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的酸性多糖。
圖3 GSPA-0.3的UV光譜(A)和FT-IR光譜(B)
3. 分子量和單糖組成分析
通過HPGPC和HPSECMALLS-RI分析，GSPA-0.3的相對分子量和絕對分子量分別為63,350 Da和62,722 Da，顯示出較高的分子量均勻性。單糖組成分析表明，GSPA-0.3主要由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖和半乳糖醛酸組成，其中半乳糖醛酸的比例最高。
圖4 (A) HPGPC光譜;(B) GSPA-0.3的摩爾質(zhì)量分布色譜圖;(C-D)標(biāo)準(zhǔn)樣品和GSPA-0.3的單糖組成譜
4. 鍵合結(jié)構(gòu)分析
采用甲基化和GC-MS分析揭示了GSPA-0.3中糖殘基的鍵合結(jié)構(gòu)，包括11種不同類型的鍵。其中，4-Gal(p)-UA（半乳糖醛酸的4位連接）占據(jù)最大比例，表明它是GSPA-0.3的主要骨架結(jié)構(gòu)。此外，該分析還確認(rèn)了GSPA-0.3中各種糖殘基的相對比例，與單糖組成數(shù)據(jù)相近。
5. 核磁共振分析
通過一維和二維核磁共振分析，GSPA-0.3的結(jié)構(gòu)得到了深入解析。在核磁共振波譜中，特定的化學(xué)位移（δ值）揭示了GSPA-0.3的糖殘基構(gòu)型和連接模式。δ 4.3-5.5 ppm范圍內(nèi)的1H和δ 92-110 ppm范圍內(nèi)的13C信號確認(rèn)了α-和β-構(gòu)型的存在。δ 170 ppm附近的信號則證明了糖醛酸的存在，這與之前的單糖組成分析一致。結(jié)構(gòu)分析顯示，GSPA-0.3的主骨架由[→3)-α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA-(1→3,4)-α-D-GalpA-(1→]的重復(fù)單元組成。此外，分支結(jié)構(gòu)包括[α-L-Araf-(1→3,5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→)]、[α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→)]、[β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→)]和α-D-GalpA-(1→)單位，這些單位直接連接在主骨架的特定位置上。
表1 GSPA-0.3甲基化結(jié)果(%)
圖5 GSPA-0.3的(A)1H NMR、(B)13C NMR、(C)DEPT-135、(D)COSY、(E)HSQC、(F)HMBC、(G)NOESY、(H)HSQC- TOCSY譜
表2 GSPA-0.3的化學(xué)位移
圖6 (A) GSPA-0.3的結(jié)構(gòu);(B) GSPA-0.3的結(jié)構(gòu)公式
6. 掃描電鏡和原子力顯微鏡分析
GSPA-0.3通過掃描電鏡(SEM)和原子力顯微鏡(AFM)觀察，呈現(xiàn)出不對稱的片狀結(jié)構(gòu)裂紋，顯示其非晶結(jié)構(gòu)特性。AFM圖像揭示了GSPA-0.3的微觀結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)島狀結(jié)構(gòu)，大小在4.2 nm至6.6 nm之間。這些特征表明GSPA-0.3的聚集結(jié)構(gòu)可能是由分子鏈的相互纏繞以及分子間和分子內(nèi)氫鍵的相互作用形成的。
7. 三螺旋結(jié)構(gòu)分析
通過剛果紅法檢測，GSPA-0.3在增加NaOH濃度的過程中，其剛果紅多糖復(fù)合物的最大吸收波長(λmax)變化不顯著，表明GSPA-0.3不存在典型的三螺旋結(jié)構(gòu)。這一發(fā)現(xiàn)提供了關(guān)于GSPA-0.3結(jié)構(gòu)特性的重要信息，對于理解其生物活性和潛在應(yīng)用具有意義。
8. 熱性質(zhì)研究
通過熱重法(TG-DTG)和差示掃描量熱法(DSC)對GSPA-0.3的熱性質(zhì)進(jìn)行了評估。在30°C至800°C的溫度范圍內(nèi)，GSPA-0.3經(jīng)歷了三個(gè)顯著的質(zhì)量損失階段，分別歸因于水分蒸發(fā)、多糖結(jié)構(gòu)解聚和有機(jī)物氧化分解。DSC分析顯示，GSPA-0.3在第一次加熱循環(huán)中表現(xiàn)出無定形性質(zhì)的不穩(wěn)定性，而在冷卻和第二次加熱循環(huán)中則顯示出可能的結(jié)晶趨勢。這些熱性質(zhì)數(shù)據(jù)為GSPA-0.3的穩(wěn)定性和加工應(yīng)用提供了重要參考。
圖7 GSPA-0.3的SEM (A-C)和AFM (D-E)
圖8 (A) TG-DTG曲線，(B)第一個(gè)升溫DSC曲線，(C)冷卻DSC曲線，(D)第二個(gè)升溫DSC曲線(升溫速率10℃/min, N2環(huán)境)
9. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
通過CCK-8法檢測，GSPA-0.3顯著促進(jìn)了脾細(xì)胞的活力和增殖，且這種促進(jìn)作用呈劑量依賴性。與H1N1組和明礬組相比，GSPA-0.3顯示出更高的促增殖活性。在免疫小鼠中，GSPA-0.3顯著提高了IgG、IgG1、IgG2a水平及IgG2a/IgG1比值，表明其增強(qiáng)了特異性抗體水平和體液免疫反應(yīng)。此外，高劑量GSPA-0.3更有效地提高了中和抗體水平。
圖9 (A) GSPA-0.3對脾細(xì)胞活力的影響。(B-D) GSPA-0.3與H1N1疫苗、Con A和LPS共孵育時(shí)對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響
圖10 GSPA-0.3對小鼠h1n1特異性抗體水平的影響
圖11 小鼠h1n1特異性中和抗體水平
流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，GSPA-0.3顯著提高了免疫小鼠CD3+/CD4+和CD3+/CD8+比值，表明GSPA-0.3對T細(xì)胞亞群有積極影響，且效果優(yōu)于明礬佐劑。RT-PCR和ELISpot分析表明，GSPA-0.3顯著提高了T-bet、GATA-3、IFN-γ和IL-4等促炎細(xì)胞因子編碼基因的表達(dá)水平，促進(jìn)了Th1和Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子表達(dá)，呈劑量依賴性。
圖12 取免疫小鼠脾細(xì)胞，用CD3+/CD4+/CD8+抗體染色
圖13 RT-PCR檢測T-bet (A)、GATA-3 (B)、IFN-γ (C)、IL-4 (D) mRNA轉(zhuǎn)錄水平
組織學(xué)觀察顯示，GSPA-0.3增強(qiáng)了免疫小鼠脾臟白髓生發(fā)中心和邊緣帶淋巴細(xì)胞數(shù)量，脾小體體積也增大，這些變化提示GSPA-0.3增強(qiáng)了免疫小鼠對H1N1疫苗的免疫應(yīng)答。
圖14 GSPA-0.3對免疫小鼠IFN-γ和IL-4水平的影響
圖15 小鼠脾臟HE染色
10. 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
在24小時(shí)內(nèi)，GSPA-0.3顯著增強(qiáng)DC2.4細(xì)胞活力，但高劑量在48小時(shí)后對細(xì)胞具有毒性。GSPA-0.3通過增加CD11c+/CD80+、CD11c+/CD86+和CD11c+/MHCII的表達(dá)來促進(jìn)DC2.4細(xì)胞的成熟，但高劑量（400 μg/mL）的影響略有減弱。GSPA-0.3促進(jìn)了DC2.4細(xì)胞對FITC-OVA抗原的攝取，顯示其作為免疫佐劑的潛力。
圖16 GSPA-0.3對DC2.4細(xì)胞作用24 h (A)和48 h (B)的影響
GSPA-0.3顯著上調(diào)DC2.4細(xì)胞中TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，表明GSPA-0.3能夠激活DC2.4細(xì)胞并促進(jìn)TLR4-MyD88-NF-κB信號通路的活性。
圖17 GSPA-0.3對DC2.4細(xì)胞成熟的影響(A-D)
圖18 GSPA-0.3增強(qiáng)DC2.4細(xì)胞的抗原攝取
圖19 GSPA-0.3上調(diào)DC2.4細(xì)胞中TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平
通過Western blot分析，GSPA-0.3顯著提高了DC2.4細(xì)胞細(xì)胞核中NF-κB、MyD88、TRAF-6和TLR4蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了GSPA-0.3激活TLR4-MyD88-NF-κB信號通路的作用。
圖20 GSPA-0.3上調(diào)DC2.4細(xì)胞核中TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB的表達(dá)水平
該研究從人參根中分離到一種新的酸性多糖(GSPA-0.3, Mw: 62,722 Da)，并確定其結(jié)構(gòu)主要由半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和鼠李糖組成，其中有甘露糖和木糖。GSPA-0.3是一種獨(dú)特的高支鏈多糖，其主鏈由→4)-α-D-galpa-(1→，→3)-α-L-rhap-(1→，和→3,4)-α-D-galpa-(1→組成，與其他已報(bào)道的多糖不同。GSPA-0.3的分支程度與其活性有關(guān)。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)可能是其佐劑活性的基礎(chǔ)，因?yàn)樵谌藚⒏袥]有發(fā)現(xiàn)其他部分具有類似的活性。本文首先通過廣泛篩選發(fā)現(xiàn)GPSA-0.3的佐劑活性超過Al佐劑?？偟膩碚f，本研究的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了GSPA-0.3作為H1N1疫苗有希望的輔助候選物的潛力。
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排版：野凌
審核：三黍生物企宣部
