文獻(xiàn)解讀 | 中藥文章提分思路大公開！福州市第二醫(yī)院IF 6.7代謝+網(wǎng)絡(luò)藥理，多組學(xué)+簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)方法立馬學(xué)會(huì)
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（PMOP）是老年女性缺乏雌激素所導(dǎo)致的骨質(zhì)流失引起的全身性代謝疾病，中藥制劑健骨顆粒已被證實(shí)是治療PMOP的有效方法，但其調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
2024年1月發(fā)表在Phytomedicine上的題為“Jiangu granules ameliorate postmenopausal osteoporosis via rectifying bone homeostasis imbalance: A network pharmacology analysis based on multi-omics validation”的文章，作者利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)健骨顆粒可以調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄失衡，并通過類固醇通路等來治療PMOP。
大鼠
轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，骨組織染色，qRT，WB
樣本總離子流圖如圖1A，作者選擇了5種主要組分（苦卷素，柚皮素，藏紅花素I，藏紅花素II和姜黃素）用標(biāo)準(zhǔn)品確認(rèn)了物質(zhì)信息（圖1B）。
圖1 健骨顆粒的總離子色譜圖
為了確定健骨顆粒的最佳治療劑量，作者設(shè)置了對(duì)照組Sham，模型組OVX，JG（7ml/kg/d），JG（14ml/kg/d）和雌激素組（E）。骨小梁的染色和定量結(jié)果均表明，JG組有顯著的治療效果，但不同劑量間無顯著差異（圖2A-B），因此7ml/kg/d被用來做后續(xù)的分析。血清的肝腎毒性結(jié)果表明，ALT，AST，TB，BUN和Cr均無差異，證明藥物對(duì)肝腎功能沒有顯著影響（圖2C）。
圖2 健骨顆粒的劑量選擇和毒理學(xué)結(jié)果
為了確定健骨顆粒的療效，作者首先利用qPCR和WB分析了成骨過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子CoLLa1、骨鈣素（OST）、Osterix（OSX）和RunX2的表達(dá)量，結(jié)果顯示健骨顆粒治療后，卵巢切除造成的蛋白表達(dá)下降均有所回升（圖3A-B，E）。股骨顯微CT和進(jìn)一步分析表明，治療組有更高的骨密度，骨體積/組織體積分?jǐn)?shù)和更低的骨小梁間距（圖3C-D）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了健骨顆粒在治療PMOP方面的卓越療效。
圖3 健骨顆粒可有效治療PMOP
根據(jù)蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組鑒定出16個(gè)PMOP相關(guān)基因
根據(jù)絕經(jīng)后正常和骨質(zhì)疏松人群的組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果，作者篩選出了1301個(gè)上調(diào)基因和1001個(gè)下調(diào)基因，以及124種上調(diào)蛋白和87種下調(diào)蛋白（圖4A-C）。通過關(guān)聯(lián)分析，最終鑒定到了16個(gè)共表達(dá)基因，其中10個(gè)（DMD, HSPB1, F7, NEB, AGL, PRNP, FABP3, CDH13, MBP和FBP2）在PMOP組中下調(diào)，6個(gè)（CYBB, SRPK1, SRGN, PACS1, RBPJ和BYSL）在PMOP中上調(diào)（圖4D-G）。
圖4 蛋白質(zhì)組的差異分析
選定基因通過影響單核細(xì)胞調(diào)控PMOP
臨床數(shù)據(jù)結(jié)果表明，PMOP中的單核細(xì)胞高于正常人。而前述16個(gè)基因中，下調(diào)基因之間顯著正相關(guān)，上調(diào)基因之間顯著負(fù)相關(guān)，功能富集中也顯示出與單核細(xì)胞的一致性（圖5A-C）。但是相關(guān)性分析中，基因表達(dá)與免疫細(xì)胞并未顯示出相關(guān)性，這表明單核細(xì)胞在PMOP的作用并不依賴于免疫細(xì)胞（圖5D-E），即篩選出的16個(gè)基因可能是通過單核細(xì)胞導(dǎo)致PMOP發(fā)生發(fā)展的潛在致病因素。
圖5 PMOP相關(guān)基因的功能與單核細(xì)胞有關(guān)
PMOP的基因亞型分類
根據(jù)聚類變量分析，PMOP患者被分為兩個(gè)亞型（圖6 A-D），16個(gè)基因中有10個(gè)在亞型2中低表達(dá)，但在亞型1中高表達(dá)（圖6 E-F），而另外6個(gè)基因的表達(dá)模式則相反。兩組不同亞型基因中不同的基因表達(dá)模式，反應(yīng)了它們?cè)赑MOP中的不同功能。
圖6 PMOP基因型相關(guān)的兩種亞型
類固醇和Notch通路介導(dǎo)骨穩(wěn)態(tài)失調(diào)
基于GSVA進(jìn)行通路富集分析后，有46條和24條通路分別與PPG（前述的10個(gè)基因集）和PHG（前述的6個(gè)基因集）相關(guān)，其中6條與PMOP保護(hù)相關(guān)的通路被確定（圖7A）。此外，在高骨密度和低骨密度的個(gè)體中進(jìn)行的分析中，“類固醇”、“Notch”和“慢性粒細(xì)胞白血病”表現(xiàn)出差異（圖7B-C）。相關(guān)性分析顯示Notch通路與PPG呈正相關(guān)，與PHG呈負(fù)相關(guān)，相反，類固醇通路與PPG呈負(fù)相關(guān)，與PHG呈正相關(guān)（圖7D）。基于這些發(fā)現(xiàn)，Notch和類固醇通路似乎共同作用，通過調(diào)節(jié)PPGs和PHGs來介導(dǎo)骨穩(wěn)態(tài)的失衡。
圖7 富集分析確定了PMOP與差異基因相關(guān)的通路
健骨顆粒通過靶向通路調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)失衡
健骨顆粒的靶基因和疾病相關(guān)基因之間的overlap分析獲得了10個(gè)重疊基因，這些基因均參與了類固醇通路，包括“類固醇代謝過程”、“類固醇羥化酶活性”和“類固醇激素生物合成”（圖8A-B）。此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果也表明，健骨顆粒中的活性成分與Notch通路和類固醇通路之間存在關(guān)聯(lián)。健骨顆粒中的獨(dú)特成分可能會(huì)糾正PPG和PHG表達(dá)的不平衡，從而改善與PMOP相關(guān)的骨穩(wěn)態(tài)的破壞，相關(guān)基因的qPCR結(jié)果和WB結(jié)果也驗(yàn)證了該推論，且單核細(xì)胞的變化也有所回復(fù)（圖8C-I）。
圖8 健骨顆粒可以恢復(fù)骨穩(wěn)態(tài)平衡
在這項(xiàng)研究中，作者整合了蛋白組和轉(zhuǎn)錄組相關(guān)數(shù)據(jù)，鑒定到了單核細(xì)胞相關(guān)的PMOP相關(guān)基因即健骨顆粒治療疾病的相關(guān)通路，證實(shí)了其可以通過PPG和PHG的平衡重塑來修復(fù)骨平衡失調(diào)，這為健骨顆粒今后的臨床應(yīng)用提供了分子機(jī)制基礎(chǔ)。
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排版：野凌
審核：三黍生物企宣部
