發酵神曲(Massa Medicata Fermentata, MMF)是一種中藥，為辣蓼、青蒿、杏仁等藥加入面粉或麩皮混合后，經發酵而形成的曲劑。臨床上常用的MMF有兩種形式，即生制MMF和炒制MMF。
根據中醫理論，炒制能引起中藥生物活性的變化。炒制MMF比生制MMF有更強的健脾作用。非揮發性和揮發性化合物的含量在翻炒后發生變化，pH值降低。與中性多糖相比，酸性多糖由于其結構特性(包括糖醛酸含量、分子量和單糖組成)而具有更好的生物活性。但是關于MMF中酸性多糖在炒制前后結構特征和生物活性變化的研究較少，導致MMF中活性物質作用應用有限。因此，在前期研究的基礎上，進一步研究生制、炒制MMFs中酸性多糖的精確結構，將有助于厘清其生物活性的差異。
2024年1月，齊魯理工大學在International Journal of Biological Macromolecules發表了”Structure and properties of acidic polysaccharides isolated from Massa Medicata Fermentata: Neuroprotective and antioxidant activity”的文章。作者通過柱層析分離純化生制和炒制的MMFs中的酸性多糖，并利用分子量、單糖組成、核磁等現代方法比較它們的結構性質。闡述了神曲多糖在斑馬魚體內抗氧化和神經保護活性。確定了從MMF中提取的酸性多糖的構效關系。該研究為探討MMF的炒制機理提供了參考，并為MMF及其炒制產物中活性物質的研究提供了理論依據。
SMMFAP：生制MMF的酸性部分；
CMMFAP：炒制MMF的酸性部分。
1.神曲多糖的理化結果及分子量分布
測定了神曲多糖的理化性質，結果表明SMMFAP和CMMFAP的總多糖及蛋白含量分別為71.86±0.21%和78.56±0.57%以及7.82±0.09%和7.13±0.57%。與之前的研究相比，生制MMF中酸性多糖的總多糖含量低于中性多糖，而蛋白質含量高于中性多糖。而炒制MM則是相反，可能炒的過程產生了這些影響。
SMMFAP和CMMFAP均為單峰。SMMFAP和CMMFAP的平均Mw分別為26.437和15.565 kDa(圖1)。顯然，在炒制過程中經過高溫處理后，多糖的平均Mw下降，這可能是由于高溫去除結合水導致多糖結構破壞和降解。
圖1. SMMFAP (A) 和 CMMFAP (B)的平均分子量
2. 神曲多糖的單糖組成
圖2. 離子色譜的單糖結果，SMMFAP (A) 和 CMMFAP (B).
表1. 離子色譜的單糖結果，SMMFAP (A) 和 CMMFAP (B).
3.神曲多糖的紅外結果
SMMFAP和CMMFAP的FTIR光譜（見圖3），在3368 cm-1附近觀察到的寬頻帶與-OH基團的伸縮振動吸收峰有關，在2921 cm-1附近是C-H的吸收峰。CMMFAP和SMMFAP的整體結果相似，例如1664 cm-1處的吸收帶是羧基C—O的特征，表明存在醛酸。1407 cm-1處的吸收歸因于GalA和GlcA的對稱C—O拉伸等。
與CMMFAP相比，SMMFAP具有更高的β型糖苷鍵含量，根據單糖組成分析結果，這可歸因于Gal和Man的相對比例降低，Ara的相對比例提高。
圖3. SMMFAP (A) 和 CMMFAP (B).的紅外結果
4.神曲多糖的甲基化結果
為了研究糖苷鍵的類型，對SMMFAP和CMMFAP鍵合結構解析 (圖4)。結果表明SMMFAP和CMMFAP都是由不同的鍵合結構組成的，并且這些多糖的結構相對復雜。
甲基化分析結果表明，SMMFAP和CMMFAP都是由末端加鏈糖組成，主要構成有所不同。
與CMMFAP相比，SMMFAP的糖苷鍵類型更為復雜，說明在高溫炒制處理下，一些糖苷鍵斷裂并重新連接。另外，經過炒制，生成了新的糖苷鍵類型(1,4,6- glcp)，這可能是由于糖苷鍵在高溫處理下首先斷裂，然后一些新的糖苷鍵發生氧化還原反應。這些酸性多糖的糖苷連接類型與MMF中的中性多糖無關，這表明酸性多糖不是MMF在炒制過程中中性多糖的反應產物。
圖4. SMMFAP (A) 和 CMMFAP (B).的甲基化結果
5.神曲多糖的核磁分析
對神曲多糖的1D (1H和13C)和2D (COSY, HSQC和HMBC) NMR進行了分析(圖5-6)。在1H譜圖中，許多質子共振信號分布在δ 3.0-5.5 ppm。其中，己糖的端粒質子信號(H1)主要集中在δ 4.5 ~ 5.5 ppm。
H譜中，在δ4.53、5.20、5.21、5.17、5.03、4.50、4.44、5.01、4.56、5.42、4.41、4.48、5.30、4.52和4.94 ppm的濃度下，觀察到15個不同的異頭質子信號，分別對應于糖殘基A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M和N。再結合二維核磁信息，對SMMFAP和 CMMFAP分別進行歸屬。
圖5. SMMFAP的核磁譜圖: 1H (A), 13C (B), COSY (C), HSQC (D) and HMBC (E).
圖6. CMMFAP的核磁譜圖: 1H (A), 13C (B), COSY (C), HSQC (D) and HMBC (E).
6.神曲多糖的電鏡結果
觀察SMMFAP和CMMFAP的表面形貌。兩種多糖的表面形態有顯著差異。如圖7所示，SMMFAP呈不規則多孔結構，而CMMFAP則由零散片狀組成。這些結果表明SMMFAP可能具有更高的分支程度和更廣泛的網絡結構。CMMFAP的破碎結構可能會降低其溶解度和潤濕性。
圖7. SMMFAP (A) 和 CMMFAP (B).的電鏡結果
7.體內神經保護活性
在測試最大耐受濃度的實驗中，觀察到200 μg/mL劑量組的斑馬魚均運動緩慢，死亡較多。在此基礎上，選擇25、50和100 μg/mL的濃度進行進一步研究。
如圖8A、C所示，空白組多巴胺神經元區域長度(KB)明顯長于模型組(MX)，說明神經損傷模型建立成功。在多糖處理組，多巴胺神經元區長度隨著多糖濃度的增加而逐漸增加，并且SMMFAP和CMMFAP均具有濃度依賴性的神經保護作用。
此外，當濃度為100 μg/mL時，CMMFAP的神經保護活性優于SMMFAP（圖8D）。這些結果表明，CMMFAP的神經保護能力強于SMMFAP，使其成為治療神經損傷的有希望的候選者。
圖8. 神經保護性研究。SMMFAP(AB)， CMMFAP(CD)
8.體內抗氧化活性
如圖所示，空白組有清晰的熒光點，而模型組只有少量熒光點，說明氧化損傷模型建立成功。在多糖組中，熒光點數目隨多糖濃度的增加而增加，結果表明，SMMFAP和CMMFAP都具有抗氧化活性，并表現出強烈的濃度依賴性，且SMMFAP的抗氧化能力更強。
此外，神經保護活性的變化趨勢與抗氧化活性并不一致，這表明多糖在體內的神經保護活性并不僅僅歸因于其抗氧化能力，這與以往的研究結果不同。
這些結果進一步證明了這些酸性多糖的神經保護作用機制的復雜性。
圖9. 體內抗氧化研究。SMMFAP(AB)， CMMFAP(CD)
9.網絡藥理學分析
本項研究使用網絡藥理學分析鑒定了180個靶點。共發現與神經損傷相關的靶點566個，與氧化應激相關的靶點646個。同時使用Venny平臺篩選了17個潛在靶點。綠色，紫色和粉紅色的節點分別代表酸性多糖潛在的目標和途徑。從網絡上發現，這些酸性多糖的神經保護作用機制是復雜的，并且這些酸性多糖表現出協同作用。通過調控PI3K-Akt和NF-kappa B信號通路直接緩解神經損傷，并可通過HIF-1信號通路調節氧化應激間接治療神經損傷。
10.神曲多糖的構效關系
多糖的生物活性與其單糖組成、平均分子量和化學結構顯著相關。
總體而言SMMFAP在體內的抗氧化活性強于CMMFAP。一是SMMFAP具有較高的平均Mw，二是其葡萄糖醛酸含量更高，這可能允許SMMFAP提供更多的氫與自由基反應并將其轉化為更穩定的產物，三是其不規則的多孔結構可以儲存自由基，具有良好的抗氧化活性。
但是在神經保護活性方面，CMMFAP比SMMFAP作用更強，這可能是由于其平均Mw比更低而且Glc含量更多。總的來說，初級結構，包括單糖組成、平均分子量和表面形態，可以影響生物活性。
綜上所述，分別從生制和炒制兩種MMF中分離純化了兩種水溶性較好的酸性多糖(SMMFAP和CMMFAP)。SMMFAP的平均分子量高于CMMFAP，而CMMFAP的Ara、Glc和Xyl含量高于SMMFAP。此外，多糖中的一些糖苷鍵在翻炒后斷裂并重新連接，如1,4--glcp變成1,4,6- glcp。生物活性評價結果表明，CMMFP的體內神經保護活性優于SMMFP，而SMMFP的體內抗氧化活性優于CMMFP。
這些結果表明，酸性多糖可能是導致生制、炒制MMF療效不同的活性物質。值得注意的是，SMMFAP良好的抗氧化活性和CMMFAP良好的神經保護活性可能為MMF多糖在人體保健品中的進一步開發提供有價值的信息。盡管這些多糖具有多種潛在的應用前景，但其結構與生物活性之間的詳細關系以及這些酸性多糖生物活性的機制仍有待進一步研究。
文獻解讀:
文獻解讀 | 多組學和多模式腦電圖數據的融合有助于神經認知障礙的個性化診斷
排版：野凌
審核：三黍生物企宣
