苯并芘（Benzopyrene，Bap）是一種常見的高活性間接致癌物，是目前世界三大強致癌物之一，被認為是多環芳烴類別中普遍存在的環境污染物。先前的研究表明，Bap 的肝毒性主要是由其代謝物引起的，但Bap本身是否會誘發這種損害仍不清楚。
2023年11月發表在Redox Biology上的題為“Uncovering SOD3 and GPX4 as new targets of Benzo[α]pyrene-induced hepatotoxicity through Metabolomics and Chemical Proteomics”的文章，通過整合了代謝組學和化學蛋白質組學方法，以全面鑒定肝細胞中受Bap影響的潛在靶蛋白。最終發現Bap通過破壞SOD3和GPX4的活性來減弱抗氧化能力，這為Bap誘導肝毒性的機制提供了新的認識。
細胞
代謝組
蛋白組
ROS檢測
質粒轉染
細胞活性檢測
1.Bap對AML12細胞的毒性
作者用不同濃度的Bap處理細胞24小時后，對細胞活力進行了評估。結果表明，Bap處理后，細胞活力呈劑量依賴性下降。
2.Bap 在 AML12 細胞中誘導代謝重編程
作者選擇0.8、4和20μM的劑量做了代謝組學的分析。結果所示，對照組和治療組之間存在顯著的代謝物差異，代謝物明顯變化的熱圖顯示，Bap 暴露導致細胞中的 REDOX 平衡失調，一些變化表現出劑量依賴效應（圖1A-B）。其中，氧化谷胱甘肽、谷胱甘肽和煙酰胺表現出多種變化，并在 Bap 暴露后顯著增加，KEGG通路結果中影響最顯著的通路為谷胱甘肽代謝（圖1C-E）。
圖1 AML12細胞中Bap暴露的代謝組學分析
3.Bap 導致 AML12 氧化損傷
為了確認谷胱甘肽代謝途徑是否有害，作者通過LC-MS測定Bap暴露 1 小時和 24 小時后細胞內 GSH 和 GSSG 的比例，結果表明Bap作用1h后，由于細胞抗氧化系統被激活，GSH/GSSG 顯著增加，24h后GSH/GSSG 明顯降低，表明 Bap 暴露最終破壞了 AML12 的抗氧化系統（圖2A）。因此，作者推測Bap可能會通過干擾谷胱甘肽的代謝對細胞造成氧化損傷。為了驗證這種想法，作者進一步檢測了氧化損傷標志物的水平，數據結果表明Bap會導致氧化損傷（圖2B-D）。
圖2 Bap破壞了AML12細胞的氧化穩態
4.用 CETSA 篩選 Bap 結合蛋白
為了確認Bap 誘導細胞氧化損傷的機制，作者利用CETSA 技術篩選Bap的靶蛋白。CETSA 依靠配體結合導致靶蛋白熱穩定（或不穩定）的原理，具體工作流程如圖3A所示。對細胞進行 Bap 或 DMSO 干預，并分別在37、46、48、50、52、54 和 56 ℃下加熱后通過TMT蛋白組學進行分析，PCA結果顯示，上清液中的 Bap 結合蛋白發生了明顯變化（圖3B）。具體分析結果表明，4 μM和100 μM Bap處理組中有131個蛋白質被確定為潛在靶標。
圖3 對Bap進行CETSA分析
5.Bap 與潛在靶蛋白之間的結合親和力評估
為了研究Bap與目標蛋白（GPX4和SOD3）之間的親和力，作者使用分子對接分析進行了模擬預測，圖4A描述了GPX4（PDB ID：7L8Q）的表面，看起來相對平坦，缺乏一個定義明確的結合口袋，但Bap 能夠覆蓋蛋白質表面第46位的硒半胱氨酸活性位點。從分子對接圖來看，Bap在硒半胱氨酸結合側被疏水殘基包圍，具有很強的靜電力和范德華力。圖4B表明Bap可以嵌入SOD3的活性結合口袋（PDB ID：2JLP）。從分子對接圖來看，Bap在硒半胱氨酸結合側也被疏水殘基包圍，肝素與SOD3的結合能為-7.2 kcal/mol，親和力遠低于Bap與SOD3的結合能力（圖4C）。
總之，對接模擬和對接結合能都證明了Bap與SOD3和GPX4的良好結合能力。
圖4 GPX4和SOD3與Bap的對接分析
6.Bap與目標蛋白質的結合熱力學常數
為了研究Bap與目標蛋白質之間的結合熱力學常數，采用了通過測定溶液中相互作用的熱力學參數來研究配體受體結合的物理技術ITC，在Bap與GPX4的反應中熵顯著增加，計算得出解離平衡常數Kd為4.46 μM（圖 6A），在Bap與SOD3的反應中，是一個放熱且熵顯著降低的過程，計算得出解離平衡常數Kd為0.161μM（圖 6B）。在一定的溫度和壓力下，兩種類型的組合 Δ G 值均為負值，表明這兩種類型的結合過程均可自發發生。
圖5 結合熱力學常數計算
7.Bap降低SOD3和GPX4酶活性
為了驗證 Bap 是直接與 GPX4 和 SOD3 結合而不是與其代謝產物結合，作者通過額外的CETSA 和DARTS實驗將細胞外提取的細胞蛋白與Bap進行孵育，結果表明，Bap以劑量依賴的方式降低了GPX4 的熱穩定性，增加了SOD3的熱穩定性（圖6A-B），同時，Bap增強了GPX4對蛋白酶水解的敏感性，提高了SOD3對蛋白酶水解的抗性（圖6C-D），此外，Bap還能明顯降低細胞中GPX和SOD酶的活性（圖6E-F）。隨后使用SOD3和GPX4活性蛋白與Bap培養10分鐘，酶活結果表明，Bap對SOD3和 GPX4的活性有劑量依賴性抑制作用（圖6G-H）。
總之，上述數據闡明了Bap在抑制GPX4和SOD3方面的潛在毒性。
圖6 Bap 抑制 GPX4 和 SOD3 酶活性
8.過表達GPX4或SOD3可抑制bap誘導的氧化損傷
為了確認Bap是否通過GPX4或SOD3誘導細胞氧化應激損傷，作者通過瞬時轉染GPX4或SOD3過表達的細胞來抑制Bap的氧化毒性。結果顯示過表達GPX4和SOD3都能減輕Bap誘導的氧化損傷。如圖7所示，GPX4或SOD3的過表達降低了ROS水平（圖7A）和脂質過氧化水平（圖7B）。此外，細胞存活率檢測也證實了Bap通過GPX4和SOD3的過表達造成AML12 細胞的氧化損傷（圖7C）。
圖7 GPX4或SOD3的過表達可減輕Bap誘導的氧化損傷
在這篇研究中，作者發現了Bap能破壞氧化還原平衡，導致氧化應激損傷，并根據代謝組學和蛋白質組學的結合結果推測Bap會抑制谷胱甘肽的代謝，進而影響谷胱甘肽的抗氧化作用。此外，對接分析也表明了Bap與GPX4或SOD3的結合親和力，ITC實驗也證實了這種相互作用。這些數據為了解 Bap 誘導肝毒性的機制提供了寶貴的見解，并可為制定預防措施和治療策略提供指導。
精品解讀：
排版：野凌
審核：三黍生物市場部
