苯并芘（Benzopyrene，Bap）是一種常見的高活性間接致癌物，是目前世界三大強致癌物之一，被認為是多環(huán)芳烴類別中普遍存在的環(huán)境污染物。先前的研究表明，Bap 的肝毒性主要是由其代謝物引起的，但Bap本身是否會誘發(fā)這種損害仍不清楚。
2023年11月發(fā)表在Redox Biology上的題為“Uncovering SOD3 and GPX4 as new targets of Benzo[α]pyrene-induced hepatotoxicity through Metabolomics and Chemical Proteomics”的文章，通過整合了代謝組學(xué)和化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，以全面鑒定肝細胞中受Bap影響的潛在靶蛋白。最終發(fā)現(xiàn)Bap通過破壞SOD3和GPX4的活性來減弱抗氧化能力，這為Bap誘導(dǎo)肝毒性的機制提供了新的認識。
細胞
代謝組
蛋白組
ROS檢測
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
細胞活性檢測
1.Bap對AML12細胞的毒性
作者用不同濃度的Bap處理細胞24小時后，對細胞活力進行了評估。結(jié)果表明，Bap處理后，細胞活力呈劑量依賴性下降。
2.Bap 在 AML12 細胞中誘導(dǎo)代謝重編程
作者選擇0.8、4和20μM的劑量做了代謝組學(xué)的分析。結(jié)果所示，對照組和治療組之間存在顯著的代謝物差異，代謝物明顯變化的熱圖顯示，Bap 暴露導(dǎo)致細胞中的 REDOX 平衡失調(diào)，一些變化表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)（圖1A-B）。其中，氧化谷胱甘肽、谷胱甘肽和煙酰胺表現(xiàn)出多種變化，并在 Bap 暴露后顯著增加，KEGG通路結(jié)果中影響最顯著的通路為谷胱甘肽代謝（圖1C-E）。
圖1 AML12細胞中Bap暴露的代謝組學(xué)分析
3.Bap 導(dǎo)致 AML12 氧化損傷
為了確認谷胱甘肽代謝途徑是否有害，作者通過LC-MS測定Bap暴露 1 小時和 24 小時后細胞內(nèi) GSH 和 GSSG 的比例，結(jié)果表明Bap作用1h后，由于細胞抗氧化系統(tǒng)被激活，GSH/GSSG 顯著增加，24h后GSH/GSSG 明顯降低，表明 Bap 暴露最終破壞了 AML12 的抗氧化系統(tǒng)（圖2A）。因此，作者推測Bap可能會通過干擾谷胱甘肽的代謝對細胞造成氧化損傷。為了驗證這種想法，作者進一步檢測了氧化損傷標(biāo)志物的水平，數(shù)據(jù)結(jié)果表明Bap會導(dǎo)致氧化損傷（圖2B-D）。
圖2 Bap破壞了AML12細胞的氧化穩(wěn)態(tài)
4.用 CETSA 篩選 Bap 結(jié)合蛋白
為了確認Bap 誘導(dǎo)細胞氧化損傷的機制，作者利用CETSA 技術(shù)篩選Bap的靶蛋白。CETSA 依靠配體結(jié)合導(dǎo)致靶蛋白熱穩(wěn)定（或不穩(wěn)定）的原理，具體工作流程如圖3A所示。對細胞進行 Bap 或 DMSO 干預(yù)，并分別在37、46、48、50、52、54 和 56 ℃下加熱后通過TMT蛋白組學(xué)進行分析，PCA結(jié)果顯示，上清液中的 Bap 結(jié)合蛋白發(fā)生了明顯變化（圖3B）。具體分析結(jié)果表明，4 μM和100 μM Bap處理組中有131個蛋白質(zhì)被確定為潛在靶標(biāo)。
圖3 對Bap進行CETSA分析
5.Bap 與潛在靶蛋白之間的結(jié)合親和力評估
為了研究Bap與目標(biāo)蛋白（GPX4和SOD3）之間的親和力，作者使用分子對接分析進行了模擬預(yù)測，圖4A描述了GPX4（PDB ID：7L8Q）的表面，看起來相對平坦，缺乏一個定義明確的結(jié)合口袋，但Bap 能夠覆蓋蛋白質(zhì)表面第46位的硒半胱氨酸活性位點。從分子對接圖來看，Bap在硒半胱氨酸結(jié)合側(cè)被疏水殘基包圍，具有很強的靜電力和范德華力。圖4B表明Bap可以嵌入SOD3的活性結(jié)合口袋（PDB ID：2JLP）。從分子對接圖來看，Bap在硒半胱氨酸結(jié)合側(cè)也被疏水殘基包圍，肝素與SOD3的結(jié)合能為-7.2 kcal/mol，親和力遠低于Bap與SOD3的結(jié)合能力（圖4C）。
總之，對接模擬和對接結(jié)合能都證明了Bap與SOD3和GPX4的良好結(jié)合能力。
圖4 GPX4和SOD3與Bap的對接分析
6.Bap與目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合熱力學(xué)常數(shù)
為了研究Bap與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的結(jié)合熱力學(xué)常數(shù)，采用了通過測定溶液中相互作用的熱力學(xué)參數(shù)來研究配體受體結(jié)合的物理技術(shù)ITC，在Bap與GPX4的反應(yīng)中熵顯著增加，計算得出解離平衡常數(shù)Kd為4.46 μM（圖 6A），在Bap與SOD3的反應(yīng)中，是一個放熱且熵顯著降低的過程，計算得出解離平衡常數(shù)Kd為0.161μM（圖 6B）。在一定的溫度和壓力下，兩種類型的組合 Δ G 值均為負值，表明這兩種類型的結(jié)合過程均可自發(fā)發(fā)生。
圖5 結(jié)合熱力學(xué)常數(shù)計算
7.Bap降低SOD3和GPX4酶活性
為了驗證 Bap 是直接與 GPX4 和 SOD3 結(jié)合而不是與其代謝產(chǎn)物結(jié)合，作者通過額外的CETSA 和DARTS實驗將細胞外提取的細胞蛋白與Bap進行孵育，結(jié)果表明，Bap以劑量依賴的方式降低了GPX4 的熱穩(wěn)定性，增加了SOD3的熱穩(wěn)定性（圖6A-B），同時，Bap增強了GPX4對蛋白酶水解的敏感性，提高了SOD3對蛋白酶水解的抗性（圖6C-D），此外，Bap還能明顯降低細胞中GPX和SOD酶的活性（圖6E-F）。隨后使用SOD3和GPX4活性蛋白與Bap培養(yǎng)10分鐘，酶活結(jié)果表明，Bap對SOD3和 GPX4的活性有劑量依賴性抑制作用（圖6G-H）。
總之，上述數(shù)據(jù)闡明了Bap在抑制GPX4和SOD3方面的潛在毒性。
圖6 Bap 抑制 GPX4 和 SOD3 酶活性
8.過表達GPX4或SOD3可抑制bap誘導(dǎo)的氧化損傷
為了確認Bap是否通過GPX4或SOD3誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激損傷，作者通過瞬時轉(zhuǎn)染GPX4或SOD3過表達的細胞來抑制Bap的氧化毒性。結(jié)果顯示過表達GPX4和SOD3都能減輕Bap誘導(dǎo)的氧化損傷。如圖7所示，GPX4或SOD3的過表達降低了ROS水平（圖7A）和脂質(zhì)過氧化水平（圖7B）。此外，細胞存活率檢測也證實了Bap通過GPX4和SOD3的過表達造成AML12 細胞的氧化損傷（圖7C）。
圖7 GPX4或SOD3的過表達可減輕Bap誘導(dǎo)的氧化損傷
在這篇研究中，作者發(fā)現(xiàn)了Bap能破壞氧化還原平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，并根據(jù)代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)合結(jié)果推測Bap會抑制谷胱甘肽的代謝，進而影響谷胱甘肽的抗氧化作用。此外，對接分析也表明了Bap與GPX4或SOD3的結(jié)合親和力，ITC實驗也證實了這種相互作用。這些數(shù)據(jù)為了解 Bap 誘導(dǎo)肝毒性的機制提供了寶貴的見解，并可為制定預(yù)防措施和治療策略提供指導(dǎo)。
精品解讀：
文獻解讀 | 枸杞多糖的結(jié)構(gòu)解析及抗衰老活性機制研究
排版：野凌
審核：三黍生物市場部
更多系列：多糖系列 | 淀粉系列 | 多組學(xué)系列
