肝內膽管癌（ICC）是一種罕見的惡性腫瘤，在中國發病率很高。先前有研究認為，腫瘤內部的微生物可獨立產生抗癌作用，且不同類型的腫瘤甚至具有其獨特的群落結構，但細菌具體的生物學功能仍需進一步研究。
復旦大學附屬中山醫院樊嘉等研究團隊發表在Gut Microbes上的題為“Intratumor microbiome features reveal antitumor potentials of intrahepatic cholangiocarcinoma”的文章，通過研究肝內膽管癌的微生物群特征，發現傘菌屬在癌旁組織中含量較高，并能夠抑制腫瘤生長。
52名ICC患者的94份臨床樣本（42份配對的腫瘤（T）和癌旁（P）組織，加上未配對的3份腫瘤組織和7份癌旁組織）。
微生物組，單細胞測序，代謝組，轉錄組，HE染色，FISH，TEM實驗
1.16S rRNA測序揭示了獨特的微生物組特征
作者引入了陰性對照消除污染，分析后發現腫瘤組織和癌旁組織之間的微生物構成整體相似（圖1a），從組成多樣性上看，ICC腫瘤組織中的微生物種類更多，且其α多樣性顯著高于癌旁組織（圖1b-c）。而在β多樣性分析中，三組樣本存在顯著差異，不過相對于正常組，P組和T組之間也有很大的相似性（圖 1d）。由于所選的正常組織來自腸癌肝轉移或肝血管瘤患者，病理背景差異大，后續分析中不納入。
2.FISH、細菌培養和透射電鏡實驗顯示組織中存在活細菌和細胞內細菌
為了進一步確認細菌的存在，作者設計了肺炎克雷伯氏菌、氮質假單胞菌、毛滴蟲和真菌的 DNA 探針，并與 ICC 組織切片雜交，HE染色和FISH熒光染色顯示ICC組織中存在選定DNA（圖2a）。隨后作者通過體外培養，觀察到了菌落生成，證明腫瘤和癌旁組織中存在活菌，通過質譜鑒定到了頭狀葡萄球菌，這與微生物組的測序結果一致（圖2b）。上述實驗確定了新鮮腫瘤組織中存在活菌，但無法觀察到細菌形態。因此，作者又通過TEM實驗觀察發現，腫瘤組織和癌旁組織中存在細胞內細菌，而且這些細菌可以包裹在溶酶體中（圖 2c）。部分細菌位于細胞外，但也有部分細菌位于細胞內，這與其他研究結果一致。
圖2 驗證實驗表明組織中存在活細菌
3.單細胞轉錄組數據顯示細菌DNA轉錄產物在免疫細胞中富集
為進一步確認細菌在不同細胞類型中的分布變化，作者選取了三個組織樣本（腫瘤，癌旁，血漿）進行了scRNA-seq，通過聚類分析確認了11個細胞群，分別為成纖維細胞、內皮細胞、肝細胞、惡性細胞和多種免疫細胞（圖3a-b）。作者在初始矩陣中加入了細菌讀數，結果顯示細菌RNA不僅存在于膽管細胞和肝細胞等實質細胞中，還存在于巨噬細胞和NK細胞等多種免疫細胞中（圖3c）。通過計算細菌轉錄產物，發現血漿樣本中，這些產物多富集在粒細胞中，癌旁組織中，細菌轉錄產物在T細胞中較豐富，而在腫瘤組織中為癌變的肝細胞和膽管細胞（圖3d-e）。差異表達結果顯示，癌組織惡性細胞中的細菌轉錄含量高于癌旁組織，而T細胞中的則低于癌旁組織。
圖3 scRNA-seq分析顯示每種細胞類型中都存在細菌RNA
4.臨床因素分析表明伯克霍爾德菌與 CA199 水平負相關
通過與患者臨床信息的關聯分析，作者發現癌癥抗原CA199對腫瘤組織細菌的影響最大，其次是白蛋白和白細胞（圖4a）。瘤內微生物分類與臨床因素之間的相關性結果表明，炭疽芽孢桿菌和氮質酵母菌的數量與CA199呈正相關（圖4b）。相比之下，結核伯克霍爾德氏菌（Burkholderia tuberum）和真菌伯克霍爾德氏菌（P. fungorum）的數量與CA199呈負相關，并且與細菌在ICC癌旁組織中的高表達有關，由此作者推測它們可能具有抗腫瘤特性。
圖4 不同代謝物的變化
5.細菌微生物群可能與氨基酸生物合成有關
通過eggNOG預測，作者發現這些細菌的功能主要涉及新陳代謝，且氨基酸代謝相對豐度最高（圖5a），KEGG分析結果表明，細菌的菌落功能主要與氨基酸和核苷酸代謝碳水化合物的途徑有關（圖5b）,level 3的KEGG結果進一步顯示，細菌與氨基酸的生物合成、嘌呤代謝、嘧啶代謝和丙酮酸代謝有關（圖5c）。
圖5 細菌的功能預測分析
6.癌旁組織中伯克霍爾德氏菌的生物量較高
在門類水平上，癌旁組織中蛋白細菌的含量較高，而在癌組織中斧形菌、疣狀芽胞桿菌和鐮刀菌的含量較高（圖6a）, RT-qPCR進一步驗證了ICC患者腫瘤組織中存在大量的疣桿菌DNA（圖6b）, 蛋白桿菌DNA的情況如圖6d所示。在科、屬水平上的差異菌見圖6c，其中，P. fungorum 和 P. azotoformans 在癌旁組織中的含量高于癌組織，這與熒光半定量分析P. fungorum的結果類似。這些在癌旁組織中含量較高的細菌對腫瘤的發展可能有抑制作用。
圖6 腫瘤和癌旁組織之間細菌含量的差異分析
7.P. fungorum抑制膽管癌細胞遷移和增殖
為了驗證上述細菌的功能，作者研究了P. fungorum對人類膽管癌細胞系RBE和QBC939的影響。透孔試驗結果顯示，加入真菌上清液后，電鏡下單位面積的細胞數明顯減少，表明細胞的增殖和遷移能力減弱（圖7a），劃痕實驗中愈合率也隨著細菌上清液濃度的逐漸增加而降低（圖7b）。
接下來，作者構建了皮下腫瘤裸鼠模型進一步驗證了P. fungorum的體內功能，組別設置為傳統腫瘤移植的對照組，腫瘤細胞加活細菌組，腫瘤細胞加細菌上清液組，腫瘤細胞加活細菌并在小鼠飲用水中添加抗生素以消減小鼠體內的細菌組，結果表明，實驗組的腫瘤體積有所減少，且FISH實驗證明了腫瘤中P. fungorum的存在（圖7c-e）。
圖7 體外和體內實驗均顯示了P. fungorum對腫瘤的抑制作用
8.小鼠的轉錄組和代謝組表明細菌影響氨基酸代謝途徑
作者收集了小鼠移植腫瘤的樣本進行了代謝組分析，結果顯示共有380種差異代謝物，且兩組腫瘤樣本的全局代謝可以顯著區分。實驗組中，上調最明顯的代謝物是2-丙基戊二酸（脂肪酸類，可能與藥物代謝有關）和N-乙酰天冬氨酸谷氨酸（氨基酸、肽及其類似物），全局差異代謝物主要富集在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑中（圖8a-e）。
細胞的轉錄組結果表明，差異表達基因主要富集在碳代謝、糖酵解/糖醛酸生成、氨基酸生物合成、氨基酰-tRNA生物合成、丙酮酸代謝等中。通過與代謝組學結果比較，作者推斷氨基酸合成代謝與細菌對腫瘤的作用密切相關。
圖8 小鼠皮下移植腫瘤的代謝組學分析
在這篇研究中，作者發現了ICC中的細菌可發揮重要的抗腫瘤作用，而且腫瘤中的細菌生物量與臨床因素相關。因此，細菌微生物群的 DNA 可作為腫瘤的診斷標志物或預后標志物，甚至可作為臨床藥物治療的靶點。然而，它們與癌細胞相互作用的分子機制仍有待深入探討。
排版：野凌
審核：三黍生物市場部
