過去十年育種專家越來越關注木薯的遺傳改良，特別是在提高直鏈淀粉與支鏈淀粉比例方面，但通過傳統育種改良木薯淀粉很困難，需要利用基因編輯技術。前期研究發現SBE2是基因組編輯產生高直鏈淀粉木薯的合適目標。為了開發高直鏈淀粉木薯，研究利用雙sgRNA CRISPR/Cas9系統實現了木薯中SBE2的基因編輯。從田間收獲的突變體木薯與野生型相比，突變體的直鏈淀粉和抗性淀粉顯著增加，從而導致儲藏根中淀粉物理化學性質發生改變。該研究表明，CRISPR/Cas9介導的木薯淀粉生物合成基因突變是培育具有食品和工業應用價值淀粉新品種的有效途徑。

野生型和突變系木薯

SBE的系統發育及保守基序分析

基于CRISPR/Cas9技術構建載體和產生SBE2木薯突變體

基因組DNA提取及突變分析

蛋白質提取、酶活性分析

淀粉提取及淀粉粒徑分析

總淀粉、抗性淀粉和直鏈淀粉含量分析

淀粉糊化及熱性能分析

淀粉支化度、鏈長分布和分子量的測定

X射線衍射分析

1、 木薯SBE2基因雙sgRNA定向敲除

從NCBI GenBank獲得了不同植物種SBE的基因組和氨基酸序列。通過ClustalW對多個氨基酸序列進行比對，并在MEGA 7中構建了系統發育樹。設計了兩種不同的sgRNAs靶向SBE2的第二外顯子和第五外顯子，以保證靶基因編輯，通過根癌農桿菌介導胚性愈傷組織（FEC）轉化，利用潮霉素篩選法獲得43個轉基因木薯植株系，大多數轉基因株系都有SBE2基因突變，突變率為93.02%（40/43）。根據其編碼序列可分為8個突變系（圖1）：純合突變株系1（M1）、突變系2（M2）、突變系3、4和5（分別為M3、M4和M5）為雜合子、突變株系6和7（M6和M7）為純合突變、突變系8（M8）具有雙等位基因突變。

圖1 木薯SBE2基因組DNA序列的突變

2、木薯SBE2基因突變對田間植物生長的影響

為了探索SBE2突變是否對生長有影響，將野生型（WT）和八個SBE2突變系（稱為M系）在田間種植6個月。與野生型相比，M1-M3在內的一些品系的生長明顯減少。野生型和突變體的儲藏根表型，即根生物量、根長、根直徑和根數（圖2a-e）也不同。平均儲藏根數約為7～8根，未發現WT和突變系之間存在顯著差異（圖2a，e）。

圖2 野生型和突變體木薯植株的表型

3、 敲除SBE2的突變體直鏈淀粉含量較高

為了驗證SBE2，從儲藏根中提取總蛋白進行免疫檢測后發現，SBE2蛋白在M6-M8中未檢測到，且僅M1中的含量高于WT。PAGE顯示，SBE2的酶活性在大片段缺失突變株中發生了顯著變化（圖3a）,而SBE1蛋白的酶活性在所有突變株中均未受到影響(補充圖S2)。

      同時結果也表明，M6-M8的直鏈淀粉以及抗性淀粉高于WT，而總淀粉更低（圖3&補充圖S3a），且碘染色的結果圖（圖3d）以及分支度的結果（補充圖S3b-d）均證實了SBE2蛋白是木薯淀粉分支的關鍵蛋白，但對表征無太大影響。

圖3 SBE2突變木薯的SBE2蛋白檢測和淀粉特性

4、 SBE2突變體的糊化特性

利用RVA對SBE2突變株的淀粉糊化特性進行了分析。總體而言，高直鏈淀粉的M6-M8比WT更容易回生。熱漿粘度（HPV）反應了抗剪切力的削弱，并且M6-M8的HPV值是WT的2倍，且糊化時間以及糊化溫度均為WT的兩倍，表明淀粉的糊化速度較慢（圖4a，表2）。可見高直鏈的木薯淀粉需要更高的糊化溫度。

圖4. SBE2突變木薯淀粉的糊漿和熱特性

表2. SBE2突變木薯儲藏淀粉的粘度特性

與WT相比，M6-8的糊化起始溫度及峰值溫度更高，表明M6-M8更加難以糊化。而終止溫度以及熱焓值顯示各樣本間無顯著差異。（圖4b，表3）

表3.SBE2突變木薯的DSC特性

5、 SBE2突變體的結晶特性

與WT相比，SBE2突變體的淀粉表現出不同的結晶度類型(圖5)。WT具有A型峰的典型特征，而M6-M8突變體淀粉為典型的B型淀粉，但M1-M5則是處于A-B型淀粉的過渡階段。

圖5. SBE2突變木薯淀粉的X射線衍射圖

通過離子色譜測定了淀粉的鏈長分布。結果表明，與WT相比，M1-M5的長鏈增加明顯，而短鏈和中長鏈則略有下降，并且與M1-M5相比，M6-M8的支鏈短鏈較少，長鏈較多（圖6），表明木薯SBE2主要作用于儲藏根中支鏈短鏈的形成。

但是所有突變的淀粉顆粒大小均沒有顯著變化。通過GPC結果可以看出，M6-M8的支鏈的中長鏈和直鏈淀粉遠高于WT（圖7，表4），這和比色法估計的直鏈淀粉含量一致（圖3b）。

圖6. 野生SBE2突變型木薯淀粉支鏈長度分布的比較

圖7. SBE2突變木薯的凝膠色譜圖

表4. SBE2突變木薯淀粉的凝膠色譜(GPC)參數研究

該研究報告了通過CRISPR/Cas9介導的SBE2基因突變產生抗性淀粉增加高直鏈淀粉木薯，高直鏈木薯淀粉的糊化特性、鏈長分布和結晶度等理化性質及結構發生了改變。這些具有不同性質的高直鏈淀粉木薯淀粉可用于特定的工業領域。研究所獲得的新材料可作為親本，通過在不同轉基因系之間進行適當的自交或雜交，分離性狀，并在后代中消除Cas-9基因，產生無外源基因的植株。