甘薯（Ipomoea batatas）是世界上最富含淀粉的根系作物之一，也是人類營養和工業原料的來源。作為甘薯塊根中最重要的組成部分：淀粉，主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。已有的文獻已經證明，淀粉的生物合成需要五類核心酶，包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADPG），淀粉合酶（SS），淀粉分支酶（SBE），淀粉脫支酶（DBE）和顆粒結合淀粉合酶I（GBSSI），它們位于葉綠體或淀粉狀體中。GBSSI負責直鏈淀粉的生物合成；SBE包括淀粉分支酶I（SBEI）和淀粉分支酶II（SBEII），負責支鏈淀粉的生物合成。高支鏈淀粉具有很好的粘度和口感體驗；高直鏈淀粉相對于支鏈淀粉具有更好的工業性能和工業利用價值。已有的研究證明通過RNA干擾（RNAi）技術抑制GBSS基因，能夠顯著提高支鏈淀粉含量，形成蠟質淀粉；干擾SBE基因則可以顯著提高直鏈淀粉的含量，獲得高直鏈淀粉，但是會造成甘薯塊根發育受損，減產嚴重。目前所有已知甘薯品系直鏈淀粉含量介于15%-30%之間，工業利用價值不高。

圖 甘薯野生栽培種泰中6號和徐薯22號表型

CRISPR/Cas9介導的基因組編輯是分子育種的革命性技術，已經成功對小麥、稻米、番茄、馬鈴薯等多種農作物進行了品質改良。然而，由于甘薯基因組龐大（2n = 6x = 90）、遺傳背景復雜（六倍體）、自交不親和、遺傳轉化困難等特性，使得甘薯基礎研究嚴重滯后，新品種培育和品質改良十分困難。
       2019年9月23日，中國科學院分子植物科學卓越創新中心張鵬研究組在International Journal of Molecular Sciences雜志上在線發表了題為“CRISPR/Cas9-Based Mutagenesis of Starch Biosynthetic Genes in Sweet Potato (Ipomoea batatas) for the Improvement of Starch Quality”的研究論文。該研究首次利用CRISPR-Cas9技術在六倍體甘薯中實現了定點編輯，獲得了高直鏈和蠟質淀粉，為食品加工及工業應用提供新型原材料, 也為今后甘薯的育種提供了新的思路和技術。我公司參與了該項目，市場部經理吳銀亮為該文章并列一作。

在本研究中，該團隊選取了兩個甘薯主栽品種：淀粉型品種“徐薯22”和富含類胡蘿卜素的品種“泰中6號”（ 圖1）作為受體植物，針對淀粉生物合成途徑基因IbGBSSI和IbSBEII分別設計了兩個sgRNA靶點，對應構建了單個和雙個sgRNA靶點的CRISPR / Cas9載體（圖1a,b,c）。在該載體系統中，sgRNA采用擬南芥U6啟動子啟動；Cas9蛋白采用UBQ啟動子。終載表達載體采用pCAMBIA 1301S載體，帶潮霉素篩選抗性。針對甘薯IbGBSSI基因，文章挑選了位于74-93bp處和292-311bp處作為特異靶點，兩個靶點均位于基因第一個外顯子上；IbSBEII基因選取了6814-6833bp處作為靶點1，位于第12個外顯子上，第二個靶點位于第15個外顯子（9471-9490bp）處。單靶系統只帶有單一靶點；雙靶系統帶有2個特異性靶點。

圖1 載體及sgRNA示意圖

在分別轉化對應甘薯栽培種品系后，為驗證基因編輯效率，故對轉基因株系進行了分析。研究人員提取了轉基因株系的基因組，首先通過Cas9基因擴增，驗證株系的陽性與否。同時在在目的靶點上下游分別設計PCR擴增引物進行擴增，根據條帶大小初步判定編輯效果：單帶：可能發生點突變、移碼突變或無突變；雙帶（一大一小）：可能發生了大片段刪除。分別回收對應PCR產物進行測序，對測序結果分析表明，CRISPR / Cas9系統在甘薯基因組中達到良好的基因編輯效果，突變率達到了63%以上（Table 1）。，在單靶體系和雙靶體系中均發現了多種形式的編輯結果，如替換、插入突變、刪除突變；在雙靶體系中同時也檢測到了大片段刪除，最長可刪除2658bp（圖2，圖3）。因為甘薯是異源六倍體，理論上存在六條獨立染色體，為了弄清基因編輯的具體位置和效率，研究者又進一步對編輯位點進行了定位，通過多態位點分析，可以精確定位到編輯位點位于第幾號染色體上（圖4）。

圖2 基因編輯分析示意圖

圖3 基因編輯效果形式及定位

圖4 編輯位點染色體定位分析  由圖可知，1-24株系編輯位點位于2號染色體上

為了更進一步驗證目標基因編輯后的效果，研究者對淀粉理化性質進行了檢測，發現雖然被編輯的植株總淀粉含量不變，但直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量及鏈長發生了顯著的變化（圖5, 圖6a, 6b）。其中GBSSI基因編輯的材料直鏈淀粉明顯下降，支鏈淀粉含量上升；SBEII基因編輯的材料直鏈淀粉明顯上升，支鏈對應下降（圖5）。更進一步對鏈長分布進行分析，離子色譜分析結果顯示，在GBSSI轉基因材料中，短鏈有明顯的增加，長鏈減少；對應的SBEII材料中，短鏈則明顯減少，長鏈增加（Table 2，圖6a）；凝膠色譜對超長鏈進行分析，結果顯示在DP200以后，SBEII基因編輯材料鏈長遠高于野生型，GBSSI材料則相反（圖6b）。

圖5 直鏈淀粉含量結果

圖6 鏈長分布結果

綜上，該研究首次實現CRISPR/Cas9編輯甘薯淀粉合成基因改良了淀粉的品質，為今后甘薯分子育種及多倍體作物基因編輯提供了新方向。
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