多糖具有多種生物活性，而多糖的結構是影響其生物活性的關鍵因素。近幾十年來多糖研究已經取得極大進步，但是受多糖分離純化及其結構復雜性的限制，其結構分析一直是多糖研究中的難題，核磁作為研究結構經典的手段之一在多糖結構解析中起到關鍵作用，通過一維¹H NMR和¹³C NMR譜可得到其整體結構信息，二維NMR譜則能給出相關碳氫連接方式方面的信息。

核磁共振（NMR）的原理主要是利用原子核在強磁場中發生能級分裂，吸收外來電磁輻射后發生核自旋能級的躍遷，即產生核磁共振。相比經典的化學法，多糖核磁解析具有無破壞性，樣品可回收性的獨特優勢。

三黍生物核磁解析2.0版本全新升級，從儀器平臺、圖譜掃描到分析內容、圖片形式等做了一系列的增補與更新，全面提升檢測能力與數據質量，以期為廣大科研用戶提供更多有價值的信息，助力科學研究。

三黍生物在保留已有圖譜（¹H、¹³C、COSY、NOESY、HSQC和HMBC）分析的基礎上，新增了近年來文獻中經常出現、客戶反饋訴求較高的兩張核磁圖譜（DEPT135和TOCSY），基本涵蓋了目前常規多糖核磁解析所需的所有圖譜。同時調整優化了解析等級，以期滿足不同客戶的解析需求。

 一維氫譜主要解決多糖結構中糖苷鍵的構型問題。多糖在¹H NMR中的信號集中于3~6 ppm。通常β-糖苷鍵構型的異頭氫信號主要分布在δ 4.3~4.9 ppm，α-糖苷鍵構型的異頭氫信號主要分布在δ 4.9~5.8 ppm。

與¹H NMR相比，多糖在¹³C NMR中的化學位移信號分布較寬。譜線重疊少，可以提供糖殘基信息（多糖在¹³C NMR中的異頭碳信號集中于95-110ppm）， 確定糖鏈的連接位置和某些特定基團 （如 δ 170～176 范 圍 的 己 糖 醛 酸 的 羧 基 或 乙 酰 氨 基 信號）。

氫-氫相關譜（COSY）是最常用的同核位移相關譜。一般反映的是鄰碳氫的偶合關系，從而可知同一自旋體系里質子之間的偶合關系，是歸屬譜線、推導結構強有力的工具。同一糖殘基的¹H信號將在對角線上相交，交點稱對角峰（diagonal peak）。圖上對角線兩側呈對稱分布的兩個點叫相關峰 （cross peak,或correlation peak）。相互偶合的兩個/組1H信號將在相關峰上相交，主要解析的是相鄰或相間質子氫相關信號。

NOESY屬NOE類的二維核磁共振譜。NOE主要用來確定兩個質子在分子立體空間結構中是否距離相近，若存在NOE則表示兩者接近，NOE值越大，則兩者在空間的距離就越近。NOE對確定有機化合物的結構、構型和構象具有重要作用。

圖3 a. COSY—無標峰

圖3 b. COSY—高級圖

圖3c. COSY—超級 

圖4 a. NOESY—無標峰

圖4 b. NOESY—高級

圖4 c. NOESY—超級

HSQC譜是C-H 異核單量子相關譜。HSQC把¹H 核和與其直接相連的¹³C核關聯起來，所提供的信息及譜圖與¹³C-¹H COSY譜相同。它同HMBC一樣也是通過測定靈敏度高的¹H核來檢測¹³C-¹H之間的遠程偶合相關信息，靈敏度比傳統的遠程偶合¹³C-¹H COSY高得多。

HMBC譜是C-H 異核多鍵相關譜。HMBC可高靈敏地檢測碳與氫的遠程偶合信號，即相鄰兩個糖殘基之間的C與H的偶合。通過異頭氫（碳）與另一糖殘基相連的碳（氫）偶合，推斷單糖殘基間的連接片段和順序。

圖5 a. HSQC—無標峰

圖5 b. HSQC—高級

圖5 c. HSQC—超級

圖6 a. HMBC—無標峰

圖6 b. HMBC—高級

圖6 c. HMBC—超級

DEPT譜又稱為無畸變極化轉移技術，在NMR中用來區分伯仲叔季碳的一種譜圖。DEPT-135譜圖的甲基，次甲基的峰向上（即信號為正），亞甲基為倒峰（即信號為負），季碳在DEPT譜圖中沒有信號，通過和全譜（¹³C NMR）比較可以明確季碳和亞甲基信號，進一步驗證¹³C NMR解析數據的準確性。

圖7 a. DEPT135—無標峰

圖7 b. DEPT135—高級

圖7 c. DEPT135—超級

總相關譜TOCSY是一個典型的同核二維譜圖。該實驗即是利用自旋鎖定過程中的等頻混合條件，使完整耦合自旋鏈上的所有氫原子核間產生交叉峰，從而進行結構鑒定，非常適合解析復雜偶合體系。結合COSY共同分析，對復雜的重疊譜圖進行解析，從端基質子出發，逐個解析出與其耦合的質子，進一步確認COSY圖譜分析的準確性。

圖8 a. DEPT135—不含標峰

圖8 b. DEPT135—高級

圖8 c. DEPT135—超級

核磁共振波譜儀是研究原子核在強磁場中對射頻輻射吸收的儀器，是對各種有機和無機物的成分、結構進行定性定量分析的最強有力的工具之一。可應用于有機化學、生物化學、藥物化學等領域的結構分析和性能研究，也可用于液體、可溶性有機物、聚合物的分子結構和分子之間相互作用研究。

500M核磁共振波譜儀配備了5mm BBFO高分辨液體探頭，具有高精度變溫實驗功能，具有獲得最佳一維、二維及多維譜圖的數據處理速度與存貯能力，主要用于有機化合物、天然產物等樣品的結構鑒定等研究。新增的600M核磁共振波譜儀屬于高場譜儀，配備超低溫探頭，具有高分辨率和高靈敏度的優勢，可以實現對微量樣品的高效檢測，為多糖結構確證提供更為準確的分析。

圖9原有Bruker 500MHz核磁共振波譜儀 （左圖）

新增Bruker 600MHz核磁共振波譜儀（右圖）

題目：Structural characterization of a Chlorella heteropolysaccharide by analyzing its depolymerized product and finding an inducer of human dendritic cell maturation

期刊：Carbohydrate Polymers

IF：11.2

時間：2024

技術方法：分子量分析、單糖組成、鍵合形式分析、自由基解聚、NMR、流式細胞術、ELISA、MLR

文章略讀：

小球藻多糖因其產量高、具有顯著的免疫調節活性而受到人們的廣泛關注，該研究從小球藻中分離得到一個主要多糖組分CPP-3a，并通過分析自由基解聚法制備的低分子量產物研究了其詳細結構。

結果表明，CPP-3a的分子量為 195. 2kDa，主要由阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等多種糖殘基構成，根據DEPT-135譜6對各糖殘基的C-6位置初步確定，結合COSY、TOCSY和ROESY譜歸屬了每個殘基內自旋耦合體系中C-2到C-5/6位的質子信號，并在HSQC和HMBC譜中發現了它們之間的關聯碳信號。綜合分析其解聚產物的核磁共振譜圖發現其具有復雜的高度支化結構。生物學實驗表明，CPP-3a 具有促進人DC（dendritic cell，樹突細胞）成熟和T細胞刺激作用，可能是一種新型 DC 成熟誘導劑，在 DC 免疫療法中具有潛在的開發價值。

參考文獻：Chen J Q, Miao W, Liu Y, et al. Structural characterization, molecular dynamic simulation, an-d conformational visualization of a water-soluble glucan with high molecular weight from Gastrodia elata Blume. International Journal of Biological Macromolecules. 2024 Apr, 263: 130207. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.130207.

糖類化合物由于分子量大，其結構分析一直以來都是工作難點。新增的兩張圖譜（DEPT135、TOCSY）為多糖分析提供了更多的信息，進一步驗證解析結果的準確性，使研究內容更加豐富可信。

排版：野凌

審核：三黍生物企宣部