多糖具有多種生物活性，而多糖的結(jié)構(gòu)是影響其生物活性的關(guān)鍵因素。近幾十年來多糖研究已經(jīng)取得極大進步，但是受多糖分離純化及其結(jié)構(gòu)復雜性的限制，其結(jié)構(gòu)分析一直是多糖研究中的難題，核磁作為研究結(jié)構(gòu)經(jīng)典的手段之一在多糖結(jié)構(gòu)解析中起到關(guān)鍵作用，通過一維¹H NMR和¹³C NMR譜可得到其整體結(jié)構(gòu)信息，二維NMR譜則能給出相關(guān)碳氫連接方式方面的信息。

核磁共振（NMR）的原理主要是利用原子核在強磁場中發(fā)生能級分裂，吸收外來電磁輻射后發(fā)生核自旋能級的躍遷，即產(chǎn)生核磁共振。相比經(jīng)典的化學法，多糖核磁解析具有無破壞性，樣品可回收性的獨特優(yōu)勢。

三黍生物核磁解析2.0版本全新升級，從儀器平臺、圖譜掃描到分析內(nèi)容、圖片形式等做了一系列的增補與更新，全面提升檢測能力與數(shù)據(jù)質(zhì)量，以期為廣大科研用戶提供更多有價值的信息，助力科學研究。

三黍生物在保留已有圖譜（¹H、¹³C、COSY、NOESY、HSQC和HMBC）分析的基礎(chǔ)上，新增了近年來文獻中經(jīng)常出現(xiàn)、客戶反饋訴求較高的兩張核磁圖譜（DEPT135和TOCSY），基本涵蓋了目前常規(guī)多糖核磁解析所需的所有圖譜。同時調(diào)整優(yōu)化了解析等級，以期滿足不同客戶的解析需求。

 一維氫譜主要解決多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵的構(gòu)型問題。多糖在¹H NMR中的信號集中于3~6 ppm。通常β-糖苷鍵構(gòu)型的異頭氫信號主要分布在δ 4.3~4.9 ppm，α-糖苷鍵構(gòu)型的異頭氫信號主要分布在δ 4.9~5.8 ppm。

與¹H NMR相比，多糖在¹³C NMR中的化學位移信號分布較寬。譜線重疊少，可以提供糖殘基信息（多糖在¹³C NMR中的異頭碳信號集中于95-110ppm）， 確定糖鏈的連接位置和某些特定基團 （如 δ 170～176 范 圍 的 己 糖 醛 酸 的 羧 基 或 乙 酰 氨 基 信號）。

氫-氫相關(guān)譜（COSY）是最常用的同核位移相關(guān)譜。一般反映的是鄰碳氫的偶合關(guān)系，從而可知同一自旋體系里質(zhì)子之間的偶合關(guān)系，是歸屬譜線、推導結(jié)構(gòu)強有力的工具。同一糖殘基的¹H信號將在對角線上相交，交點稱對角峰（diagonal peak）。圖上對角線兩側(cè)呈對稱分布的兩個點叫相關(guān)峰 （cross peak,或correlation peak）。相互偶合的兩個/組1H信號將在相關(guān)峰上相交，主要解析的是相鄰或相間質(zhì)子氫相關(guān)信號。

NOESY屬NOE類的二維核磁共振譜。NOE主要用來確定兩個質(zhì)子在分子立體空間結(jié)構(gòu)中是否距離相近，若存在NOE則表示兩者接近，NOE值越大，則兩者在空間的距離就越近。NOE對確定有機化合物的結(jié)構(gòu)、構(gòu)型和構(gòu)象具有重要作用。

圖3 a. COSY—無標峰

圖3 b. COSY—高級圖

圖3c. COSY—超級 

圖4 a. NOESY—無標峰

圖4 b. NOESY—高級

圖4 c. NOESY—超級

HSQC譜是C-H 異核單量子相關(guān)譜。HSQC把¹H 核和與其直接相連的¹³C核關(guān)聯(lián)起來，所提供的信息及譜圖與¹³C-¹H COSY譜相同。它同HMBC一樣也是通過測定靈敏度高的¹H核來檢測¹³C-¹H之間的遠程偶合相關(guān)信息，靈敏度比傳統(tǒng)的遠程偶合¹³C-¹H COSY高得多。

HMBC譜是C-H 異核多鍵相關(guān)譜。HMBC可高靈敏地檢測碳與氫的遠程偶合信號，即相鄰兩個糖殘基之間的C與H的偶合。通過異頭氫（碳）與另一糖殘基相連的碳（氫）偶合，推斷單糖殘基間的連接片段和順序。

圖5 a. HSQC—無標峰

圖5 b. HSQC—高級

圖5 c. HSQC—超級

圖6 a. HMBC—無標峰

圖6 b. HMBC—高級

圖6 c. HMBC—超級

DEPT譜又稱為無畸變極化轉(zhuǎn)移技術(shù)，在NMR中用來區(qū)分伯仲叔季碳的一種譜圖。DEPT-135譜圖的甲基，次甲基的峰向上（即信號為正），亞甲基為倒峰（即信號為負），季碳在DEPT譜圖中沒有信號，通過和全譜（¹³C NMR）比較可以明確季碳和亞甲基信號，進一步驗證¹³C NMR解析數(shù)據(jù)的準確性。

圖7 a. DEPT135—無標峰

圖7 b. DEPT135—高級

圖7 c. DEPT135—超級

總相關(guān)譜TOCSY是一個典型的同核二維譜圖。該實驗即是利用自旋鎖定過程中的等頻混合條件，使完整耦合自旋鏈上的所有氫原子核間產(chǎn)生交叉峰，從而進行結(jié)構(gòu)鑒定，非常適合解析復雜偶合體系。結(jié)合COSY共同分析，對復雜的重疊譜圖進行解析，從端基質(zhì)子出發(fā)，逐個解析出與其耦合的質(zhì)子，進一步確認COSY圖譜分析的準確性。

圖8 a. DEPT135—不含標峰

圖8 b. DEPT135—高級

圖8 c. DEPT135—超級

核磁共振波譜儀是研究原子核在強磁場中對射頻輻射吸收的儀器，是對各種有機和無機物的成分、結(jié)構(gòu)進行定性定量分析的最強有力的工具之一。可應用于有機化學、生物化學、藥物化學等領(lǐng)域的結(jié)構(gòu)分析和性能研究，也可用于液體、可溶性有機物、聚合物的分子結(jié)構(gòu)和分子之間相互作用研究。

500M核磁共振波譜儀配備了5mm BBFO高分辨液體探頭，具有高精度變溫實驗功能，具有獲得最佳一維、二維及多維譜圖的數(shù)據(jù)處理速度與存貯能力，主要用于有機化合物、天然產(chǎn)物等樣品的結(jié)構(gòu)鑒定等研究。新增的600M核磁共振波譜儀屬于高場譜儀，配備超低溫探頭，具有高分辨率和高靈敏度的優(yōu)勢，可以實現(xiàn)對微量樣品的高效檢測，為多糖結(jié)構(gòu)確證提供更為準確的分析。

圖9原有Bruker 500MHz核磁共振波譜儀 （左圖）

新增Bruker 600MHz核磁共振波譜儀（右圖）

題目：Structural characterization of a Chlorella heteropolysaccharide by analyzing its depolymerized product and finding an inducer of human dendritic cell maturation

期刊：Carbohydrate Polymers

IF：11.2

時間：2024

技術(shù)方法：分子量分析、單糖組成、鍵合形式分析、自由基解聚、NMR、流式細胞術(shù)、ELISA、MLR

文章略讀：

小球藻多糖因其產(chǎn)量高、具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性而受到人們的廣泛關(guān)注，該研究從小球藻中分離得到一個主要多糖組分CPP-3a，并通過分析自由基解聚法制備的低分子量產(chǎn)物研究了其詳細結(jié)構(gòu)。

結(jié)果表明，CPP-3a的分子量為 195. 2kDa，主要由阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等多種糖殘基構(gòu)成，根據(jù)DEPT-135譜6對各糖殘基的C-6位置初步確定，結(jié)合COSY、TOCSY和ROESY譜歸屬了每個殘基內(nèi)自旋耦合體系中C-2到C-5/6位的質(zhì)子信號，并在HSQC和HMBC譜中發(fā)現(xiàn)了它們之間的關(guān)聯(lián)碳信號。綜合分析其解聚產(chǎn)物的核磁共振譜圖發(fā)現(xiàn)其具有復雜的高度支化結(jié)構(gòu)。生物學實驗表明，CPP-3a 具有促進人DC（dendritic cell，樹突細胞）成熟和T細胞刺激作用，可能是一種新型 DC 成熟誘導劑，在 DC 免疫療法中具有潛在的開發(fā)價值。

參考文獻：Chen J Q, Miao W, Liu Y, et al. Structural characterization, molecular dynamic simulation, an-d conformational visualization of a water-soluble glucan with high molecular weight from Gastrodia elata Blume. International Journal of Biological Macromolecules. 2024 Apr, 263: 130207. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.130207.

糖類化合物由于分子量大，其結(jié)構(gòu)分析一直以來都是工作難點。新增的兩張圖譜（DEPT135、TOCSY）為多糖分析提供了更多的信息，進一步驗證解析結(jié)果的準確性，使研究內(nèi)容更加豐富可信。

排版：野凌

審核：三黍生物企宣部